一种新的cDNA克隆的分析及可能功能推测

筛选胎儿心脏文库时发现一个新cDNA ,Genbank搜索和BLAST表明该新cDNA和蛋白激酶A锚定蛋白AKAP95有 71 %的蛋白质相似性 ,且在 3′端存在一个锌指结构和AKAP基因特有的RII结合区域 ,因此初步判定该新cDNA为一种AKAP基因 ;该cDNA和人类 1 9号染色体的一段区域相同 ,HGP计划标明在cos midR3 3 90 7和cosmidF2 0 90 0上 ,而该两粘粒定位在 1 9号染色体的q1 3 1处 ,因此将该新基因定位于人第 1 9号染色体的q1 3 1处 ,并且同AKAP95相邻 .

利用CRISPR/Cas9技术对VSX 2绿色荧光报告基因人诱导多能干细胞系的构建

目的构建表达视觉系统同源框2(VSX 2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理,设计VSX 2的小向导RNA(sgRNA),构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒;2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系,采用嘌呤霉素筛选获得单克隆,扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型;采用核型分析法分析报告细胞系核型;采用STR法排除细胞交叉污染;采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达;通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力;应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官,并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX 2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明,BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明,BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性,包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明,由BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性;eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。结论成功构建1株表达VSX 2-eGFP报告基因的hiPSCs,该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化,为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

视网膜神经节细胞特异的报告基因干细胞系构建及其应用

青光眼是全球第二大致盲眼病,是一种无法治愈的神经退行性疾病,其特征是视网膜神经节细胞和视神经的选择性、进行性和不可逆变性。青光眼的治疗是涉及民生的重大公共卫生问题和社会问题。对视网膜神经节细胞进行深入的研究有助于青光眼的治疗。利用报告基因将视网膜神经节细胞可视化,使我们能够更直观地了解其发育过程,也有利于后续的富集再利用。封面展示了视网膜神经节细胞特异的荧光报告基因干细胞系在眼科学研究中的应用。封面主体由三个元素组成:视网膜类器官在明场下的形态、同一区域在荧光显微镜下的形态和切片染色的荧光图像组成。

视网膜神经节细胞特异的报告基因干细胞系构建及其应用

目的:建立能驱动GFP在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)中特异性表达的小鼠胚胎干细胞系。方法:通过同源重组的方式建立Brn3b-GFP敲入的小鼠胚胎干细胞系(Brn3b-GFP ESC),利用3D培养将其诱导成视网膜类器官检测GFP表达的细胞特异性,再用流式细胞分选富集GFP阳性RGC,采用玻璃体腔注射的方式将GFP阳性RGC移植到健康小鼠和NMDA损伤模型小鼠眼中探索该细胞的应用价值。结果:Brn3b-GFP ESC经3D视网膜诱导培养后在RGC中特异性表达GFP,将这些GFP阳性RGC移植到两种小鼠中2周后能在所有视网膜内观察到GFP阳性细胞存活,且均能观察到有供体RGC整合到宿主视网膜RGC层。结论:本研究建立了RGC特异的报告基因干细胞系Brn3b-GFP ESC,通过将该细胞系诱导成视网膜类器官进而获得的GFP阳性RGC移植后能够整合进宿主视网膜。该细胞系的建立将为青光眼及相关疾病提供重要的研究手段和工具。

脊椎动物视神经损伤修复与再生

视觉是脊椎动物接收外界信息的主要来源之一.视神经连通视网膜和大脑,将视觉信息传递至大脑皮层相应区域.通常认为哺乳动物视网膜神经节细胞及视神经是无法再生的,其损伤是导致失明的主要原因.视神经轴突的再生受到许多外在和内在因素限制,解除外在抑制因素,激活内源再生潜力,能够使小部分轴突成功再生,并改善部分视功能.此外,通过移植体外干细胞诱导分化的视网膜神经节细胞,或者体内重编程穆勒细胞和无长突细胞定向生成视网膜神经节细胞,均已实现了一定程度的视网膜神经节细胞再生,且可以恢复部分视功能,在青光眼等神经退行性疾病的治疗方面展现出诱人的前景.本文通过调研近年来国内外相关文献,针对脊椎动物视神经损伤后轴突再生及视网膜细胞再生相关研究进行综述.