肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识(2024版)

随着生物医学的发展,DNA甲基化(DNA methylation)标志物在癌症诊断、治疗选择及预后评估中的重要性日益凸显。本专家共识旨在全面梳理DNA甲基化标志物的检测技术、临床应用及其在肿瘤管理中的潜力。此外,本共识将围绕DNA甲基化标志物的定义、临床意义、检测规范、数据处理及其在肿瘤的筛查、辅助诊断、伴随诊断及复发监测中的应用,结合最新研究进展和实际临床经验,提出一系列关于DNA甲基化标志物检测及应用的共识推荐,旨在提升临床医技人员对这一新兴标志物的认识,规范检测流程,促进其在肿瘤诊疗全程中的应用,从而为患者提供更加精准有效的治疗方案。

槲皮素对SGC-7901胃癌细胞生长及HSP70和EGFR表达的影响

目的观察槲皮素对胃癌细胞SGC-7901生长及HSP70和EGFR的影响。方法以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫组化检测HSP70和EGFR的表达。结果台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制SGC-7901细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48 h后的IC50为14.12μmol/L。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10-20μmol/L的槲皮素处理,SGC-7901细胞周期阻滞于G0/G1期,经10μmol/L槲皮素处理的SGC-7901下调HSP70和EGFR蛋白的表达。结论槲皮素能抑制胃癌细胞的生长,呈时间剂量依赖性,能诱导SGC-7901发生凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调HSP70和EGFR的表达有关。

槲皮素对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823生长的影响

目的 观察槲皮素对胃癌细胞SGC 790 1和BGC 82 3生长和增殖的影响。方法 以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率 ,荧光显微镜了解凋亡的发生 ,流式细胞术检测细胞周期变化。结果 台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制SGC 790 1和BGC 82 3细胞增殖的作用明显 ,呈浓度和时间依赖性 ,槲皮素处理 48h后的Ic50为 14 12 μm(SGC 790 1)和 2 8 13 μm(BGC 82 3 )。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化 ,流式细胞仪检测表明经 10～ 2 0 μm/L的槲皮素处理 ,SGC 790 1细胞周期阻滞于G0 /G1期 ,BGC 82 3细胞周期阻滞于S期。结论 槲皮素能抑制胃癌细胞的生长并诱导其发生凋亡 。

槲皮素对BGC823胃癌细胞p53、Bcl-2/Bax、PCNA表达影响与抑癌作用研究

目的:观察槲皮素对胃癌细胞BGC823生长及p53、Bcl-2/Bax、PCNA的影响。方法:以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学检测p53、Bcl-2/Bax、PCNA蛋白的表达。结果:台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制BGC823细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48h后的Ic50为28.12μm。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10-20μm/L的槲皮素处理,BGC823细胞周期阻滞于S期,药物浓度呈正相关。细胞呈现核固缩、染色质边集、凋亡小体形成等典型凋亡表现。经槲皮素处理后BGC823细胞株bax蛋白表达明显增加,bcl-2、PCNAp、53蛋白表达降低。结论:槲皮素能抑制胃癌细胞的生长,呈时间剂量依赖性,能诱导BGC823发生凋亡,使细胞周期阻滞于S期,抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调p53、PCNA的表达,降低bcl-2/Bax比值有关。

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段,克隆入pET32a(+),鉴定无误后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA71,构建pLA71-omp载体,将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli/MS间进行穿梭,并在耻垢分枝杆菌中表达。

表达幽门螺杆菌外膜蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗菌对小鼠的免疫保护作用

为研究含pLAO的重组耻垢分枝杆菌疫苗(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.S)对小鼠的保护作用。将重组耻垢分枝杆菌疫苗pLAO(MS)2×107灌胃免疫接种BALB/c小鼠,同时设PBS组、耻垢分枝杆菌空菌组,免疫4周后,各组处死一批小鼠,取胃组织待用;余下的小鼠用幽门螺杆菌标准株(Helicobacter pylori SS1,Hp SS1)攻击2次,4周后处死小鼠,进行胃组织快速尿素酶试验、Hp培养、炎症程度及其炎症活动度评分,以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫保护作用,ELISA检测Hp特异性血清IgG和IgA水平。结果表明疫苗组Hp定植评分均明显低于PBS组和空菌组,疫苗组不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.S疫苗诱导的Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高。因此rM.S疫苗经灌胃接种BLAB/c小鼠能降低Hp定植,减轻胃黏膜的炎症反应,对Hp感染有明显的预防保护作用。

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。利用聚合酶链反应(Polym erase chain reaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA 73,构建pLA 73-UreB载体,将pLA 73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,W esternb lot检测UreB的表达及活性。液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1 710 bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,W estern b lot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础。

尼美舒利联合5-Fu对胃癌细胞BGC-823的抗癌作用研究

目的 :研究尼美舒利 (Nimesulide)合用 5 -Fluorouracil(5 -FU)对人胃癌细胞株BGC -82 3的生长抑制作用 ,判断联合用药的效果。方法 :采用MTT法、中效原理等测定药物的体外杀伤作用 ,进行联合用药分析。结果 :尼美舒利合用 5 -FU能显著抑制BGC -82 3的生长 ,当抑制率为 10 -95 %时 ,两药合用时合用指数 (CI) <1,为协同作用 ,使用药浓度减少 1-10倍。结论 :尼美舒利联合 5 -FU能显著增加单用其中一种药物对人胃癌细胞株BGC -82 3的抑制作用 ,两药联合应用时具有较好的协同作用。

热休克蛋白在胃溃疡中的表达及意义

随着对热休克蛋白研究的深入,热休克蛋白对胃黏膜的保护作用引越来越起人们的重视,各种热休克蛋白在胃溃疡不同时期的表达,在保护胃黏膜抵御应激损伤中起着重要作用,特别是热休克蛋白与幽门螺杆菌之间存在着天然联系,参与胃溃疡的发生、发展.因此,构建热休克蛋白疫苗和采用非毒性HSPs诱导剂对溃疡的预防及促进溃疡愈合具有重要的治疗价值.

表皮生长因子及其受体与胰腺癌的关系

自1959年Cohen等首次发现表皮生长因子(epidermlgroth facor,EGF)以来,国内外学者对表皮生长因子进行了广泛的研究,自80年代始对表皮生长因子受体的研究也成为人们关注的热点.

防止易善复与凯西莱配伍出现白色沉淀的实验研究

目的 了解易善复(肝得健)和凯西莱两种保肝药的配伍禁忌，找出防止措施。方法 采用混合实验方法观察易善复和凯西莱两者之间的反应及测定其pH值。结果 易善复和凯西莱之间由于溶剂改变存在物理配伍禁忌。结论 两者同时使用时，应间隔一组液体。

可溶性人TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823凋亡的研究

目的通过构建pBud-EGFP-TRAIL质粒体外观察可溶性人TRAIL蛋白(sTRAIL)对胃癌细胞BGC-823的作用。方法以EFGP基因为报告基因,sTRAIL为目的基因,构建pBud-EGFP-TRAIL双表达质粒,鉴定酶切和测序重组体。经脂质体转染法转染体外培养的胃癌细胞BGC-823,用荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR及Western blot进一步检测sTRAIL mRNA及其蛋白的表达,MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率,TUNEL法观察细胞的凋亡情况,流式细胞仪分析转染后胃癌细胞的凋亡率。结果测序结果证实pBud-EGFP-TRAIL载体构建成功,质粒经脂质体转染后,通过表达sTRAIL蛋白对胃癌细胞发挥作用。MTT法显示转染该质粒的细胞的生长抑制率明显高于对照组,TUNEL法显示细胞核固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体。流式细胞仪结果表明转染该质粒的细胞的的凋亡率明显高于对照组。结论在体外初步证实TRAIL能诱导胃癌细胞BGC-823凋亡。

分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定

目的用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的ApaⅠ位点与SnaBⅠ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis)mc2155中的表达情况。结果从BCG基因组中扩增出160bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致。测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M.smegmatis中成功表达。结论成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70。

PAQR3增强乳腺癌细胞SK-BR-3的表柔比星敏感性

目的探讨PAQR3增强乳腺癌细胞对表柔比星的敏感性。方法采用Real-time PCR比较ER、PR及HER2受体不同的4株乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF7、SK-BR-3及T47D)的PAQR3表达情况。在乳腺癌细胞SK-BR-3中转染人源性PAQR3全长表达质粒,设立对照组,观察比较转染PAQR3细胞组与空载质粒细胞组对表柔比星的敏感性,分别计算其所对应的IC50。通过细胞凋亡检测、Western blot探讨PAQR3增加表柔比星敏感性的机制。结果在4株乳腺癌细胞中,受体三阴性细胞MDA-MB-231的PAQR3表达量最高,SK-BR-3与MCF7表达量相对较低;SK-BR-3过表达PAQR3后,其对表柔比星的化疗敏感性显著升高,IC50显著降低[(25.33±0.94)μg/mL vs(17.72±1.11)μg/mL,P<0.05];PAQR3本身并未促使SK-BR-3凋亡,实验组与对照组的凋亡率差异并无统计学意义(P>0.05)。但在同等浓度表柔比星的作用下,PAQR3促使SK-BR-3表达凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-7,从而导致表柔比星抑制率增加,对CleavedCaspase-3、Bcl-2、Bcl-xL表达则无影响。进一步分析发现,PAQR3可抑制乳腺癌化疗中表柔比星所致的ERK活化,因而促使乳腺癌细胞对表柔比星敏感。结论 PAQR3可提高乳腺癌细胞对表柔比星的化疗敏感性,PAQR3表达可能与乳腺癌对表柔比星的敏感性相关。

sTRAIL真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的探讨可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法建立胃癌细胞株BGC-823裸鼠移植瘤模型,成瘤后于瘤内多点注射重组真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL,并设pBud-EGFP组和生理盐水组为对照,观察并记录肿瘤的生长情况。Western blot和RT-PCR检测sTRAIL mRNA和蛋白表达情况,HE染色观察肿瘤组织病理改变,TUNEL法及电镜技术观测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果注射pBud-EGFP-TRAIL组的sTRAIL mRNA和蛋白为阳性,其瘤体大小明显小于pBud-EGFP组和生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色示pBud-EGFP-TRAIL组肿瘤细胞大量死亡,电镜下可见到典型凋亡细胞,TUNEL法显示其凋亡细胞明显增多。结论sTRAIL真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL瘤内注射对人胃癌裸鼠移植瘤有抑制作用。

甲基化修饰致PCDH10基因在多发性骨髓瘤中沉默

目的研究PCDH10基因在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者及细胞系KM3、RPMI-8226中的甲基化状态,分析甲基化对其沉默的影响。方法常规骨髓穿刺术获取MM患者骨髓样本,培养骨髓瘤细胞系KM3、RPMI-8226,以增生性骨髓象骨髓样本作为对照。RT-PCR检测其中PCDH10基因表达水平,甲基化特异性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)法检测PCDH10基因甲基化状态,通过5-氮杂-2'-脱氧胞苷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂[5-aza-2'-deoxycytidine(Aza)and trichostatin A(TSA),A+T]处理MM细胞系,检测药物处理前后PCDH10甲基化状态及表达水平。结果 PCDH10基因在正常人群中表达,但在MM患者骨髓及细胞系中广泛低表达,且77.27%(34/44)的MM患者PCDH10呈甲基化状态。PCDH10基因可经A+T试验逆转甲基化状态并恢复表达。结论 DNA甲基化可能在多发性骨髓瘤的PCDH10基因沉默中发挥作用,从而参与骨髓瘤的发生。

靶向COX-2的RNA干扰抑制胃癌细胞增殖及相关信号分子改变

目的:本研究初步探讨RNA干扰技术应用于胃癌基因治疗的特异性及作用机制。方法:设计靶向COX-2基因的siRNA,构建重组表达质粒pTZU6+1-siRNA-COX-2并导入胃癌SGC-7901细胞株,在体外诱导RNA干扰,采用RT-PCR和Western blot同时检测处理组和对照组COX-2基因表达,MTT检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期;并用Westernblot检测相关信号分子p53、PCNA及Ki67蛋白表达。结果:体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6+1-siRNA-COX-2导入胃癌SGC-7901细胞株后,胃癌细胞生长明显被抑制;细胞周期相分布发生显著变化,G1/G0期细胞明显减少,S期细胞显著增加;与对照相比,COX-2 mRNA分别下调88.36%和86.24%,COX-2蛋白表达分别下调94.27%和91.59%。p53蛋白表达上调,PCNA及ki67蛋白表达均明显下调。对照组各指标均无明显变化。结论:siRNA明显抑制了COX-2的表达及胃癌SGC-7901细胞增殖,并引起细胞周期改变,可能与上调p53蛋白和下调PCNA及ki67蛋白表达有关。

真核表达载体pEGFP-N1-VP3的构建及在SGC-7901细胞中的表达和定位

构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3并稳定转染人胃癌细胞SGC-7901,观察EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中的分布和亚细胞定位,探讨凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制。用PCR技术扩增出(凋亡素)VP3基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-VP3经脂质体介导转染SGC-7901细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察凋亡素在肿瘤细胞中的分布、亚细胞定位。用AO/EB荧光染色法检测其在体外诱导肿瘤细胞凋亡的效应。经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入载体pEGFP-N1,稳定转染细胞中EGFP-VP3在肿瘤细胞中得以高表达,转染后逐渐从细胞质迁移至细胞核,最后定位于细胞核内。AO/EB荧光染色观察到大量细胞凋亡。成功构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3,并成功培养出表达绿色荧光蛋白和凋亡素的SGC-7901稳定细胞株。EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中具有核定位效应,并诱导肿瘤细胞凋亡。

靶向COX-2基因的RNA干扰治疗裸鼠胃癌的实验研究

目的:利用RNA干扰技术在裸鼠体内抑制COX-2基因表达,探讨RNA干扰对胃癌治疗的特异性和相关机制。方法:设计靶向COX-2基因的siRNA,构建重组表达质粒pTZU6+1-siRNA-COX-2并导入裸鼠皮下移植瘤,在体外诱导RNA干扰,采用RT-PCR法、免疫组化法同时检测处理组和对照组COX-2基因表达,Western blotting检测了与细胞增殖相关信号分子p53、PCNA及Ki67蛋白表达。结果:pTZU6+1-siRNA-COX-2导入裸鼠皮下移植瘤后14天,肿瘤体积明显变小。COX-2的mRNA表达由98.36%下调到43.44%,COX-2蛋白表达由86.24%下调至47.59%。PCNA及Ki67蛋白表达均明显下调。对照组各指标均无明显变化。结论:siRNA明显抑制了COX-2表达,并抑制肿瘤生长,这可能与上调p53蛋白和下调PCNA及Ki67蛋白表达有关。