大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及鉴定

目的:研究大鼠BMSCs(骨髓间充质干细胞)原代培养与纯度鉴定的方法。方法:无菌环境中,从SD大鼠股骨与胫骨端采集骨髓,先行酶消化,利用全骨髓细胞悬液贴壁法对提取BMSCs实施传代培养,选取生长良好的第3代细胞进行鉴定;对BMSCs实施成脂与成骨诱导分化,同时经由油红O(ORO)与茜素红(ARS)染色法对诱导分化效果加以鉴定;借助流式细胞术(FCM)对CD34、CD44与CD90这3类BMSCs表面标志物的表达展开分析。结果:BMSCs是长梭状贴壁细胞,生长状态为纤维细胞样漩涡状;在第3代BMSCs传代期间,其第1-3 d发展至生长潜伏期,呈较慢速的生长;第3-5 d发展至对数生长期,呈高速生长;待至第7 d长速增殖最大,速度停止上升进入平缓期;BMSCs成骨、成脂诱导结束后,对其诱导分化鉴定发现:细胞出现明显形态学变化,通过ORO对脂肪染色,细胞显示橘红色;待成骨诱导培养结束,通过ARS对钙盐染色,显示红色,且出现矿化结节沉积,说明BMSCs具有良好的成骨、成脂分化能力;FCM测定发现:CD34表达呈阴性(1.09%),CD90(96.8%)与CD44(92.4%)皆呈阳性,与BMSCs表型相符。结论:经由全骨髓黏附培养技术有效分离BMSCs,且完成培养。

低氧处理骨髓间充质干细胞来源的外泌体对宫腔粘连模型大鼠的疗效研究

目的构建宫腔粘连动物模型,并探讨低氧处理骨髓间充质干细胞(BMSC)及其来源的外泌体(BMSC-exo)对子宫内膜损伤的修复作用。方法在常规氧(21%O_(2))或低氧(1%O_(2))条件下培养从大鼠股骨中提取的BMSC及其BMSC-exo。采用刮宫+脂多糖宫腔内注射双重损伤的方法对40只健康雌性SD大鼠进行宫腔粘连建模,并于建模第28天,将40只模型大鼠采用随机数字表法随机分为5组(每组各8只),并进行干预:(1)NC组:每侧宫腔注射0.2 ml磷酸盐缓冲液;(2)BMSC组:每侧宫腔注射0.2 ml浓度1×10^(6)/ml常规氧培养的BMSC;(3)L-BMSC组:每侧宫腔注射0.2 ml浓度1×10^(6)/ml低氧培养的BMSC;(4)BMSC-exo组:每侧宫腔注射0.2 ml浓度500μg/ml常规氧培养的BMSC-exo;(5)L-BMSC-exo组:每侧宫腔注射0.2 ml浓度500μg/ml低氧培养的BMSC-exo。分别于治疗第14、28天,采用麻醉后颈椎脱臼法各处死每组大鼠4只,取子宫内膜组织,进行HE和Masson染色观察计算子宫内膜的腺体数量和纤维化情况,蛋白印迹法(western blot)检测大鼠子宫内膜组织中血管生成相关细胞因子[血管内皮生长因子A(VEGFA)、CD_(31)]和纤维化相关蛋白[胶原蛋白Ⅰ(collagen-Ⅰ)、胶原蛋白Ⅲ(collagen-Ⅲ)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)]的表达情况。结果(1)HE和Masson染色结果显示,治疗第14、28天,与NC组相比,L-BMSC组、BMSC-exo组和L-BMSC-exo组宫腔粘连模型大鼠子宫内膜腺体数量均增加、子宫内膜纤维化面积均减少(P均<0.05),且L-BMSC-exo组较BMSC-exo组变化显著(P均<0.05),BMSC-exo组较BMSC组变化显著(P均<0.05)。(2)western blot检测纤维化相关蛋白(collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1)表达结果显示,治疗第14、28天时,与NC组相比,BMSC组、L-BMSC组、BMSC-exo组和L-BMSC-exo组collagen-Ⅲ、TGF-β1的表达均降低(P均<0.05)。随着治疗时间的延长,纤维化相关蛋白表达情况不同,治疗第28天,与BMSC组相比,BMSC-exo组和L-BMSC组collagen-Ⅲ、α-SMA和TGF-β1的表达均降低(P均<0.05);且L-BMSC-exo组collagen-Ⅲ和TGF-β1的表达均较BMSC-exo组更低(P均<0.05);L-BMSC-exo组collagen-Ⅰ、α-SMA和TGF-β1的表达均较L-BMSC组更低(P均<0.05)。(3)western blot检测血管生成相关细胞因子(VEGFA、CD_(31))表达的结果显示,治疗第14、28天时,与NC组相比,BMSC组、L-BMSC组、BMSC-exo组和L-BMSC-exo组VEGFA、CD_(31)的表达均升高(P均<0.05)。治疗第28天,与BMSC组相比,BMSC-exo组VEGFA和CD_(31)的表达以及L-BMSC组CD_(31)的表达均升高(P均<0.05);且L-BMSC-exo组VEGFA和CD_(31)的表达均较BMSC-exo组和L-BMSC组更高(P均<0.05)。结论低氧处理的BMSC及其BMSC-exo均能促进宫腔粘连模型大鼠子宫内膜腺体增生,抑制纤维化,促进子宫内膜血管生成,进一步修复受损的子宫内膜。低氧处理的BMSC-exo对宫腔粘连模型大鼠具有更好的治疗效果。