辣木MoGAD基因克隆及表达分析

【目的】鉴定辣木中MoGAD基因,并对其进行克隆、生物信息学分析和表达水平分析,为探究辣木MoGAD基因的功能与γ-氨基丁酸(GABA)生物合成的关系奠定基础。【方法】以拟南芥(NP_197235.1)和葡萄(XP_002285268.1)GAD蛋白序列为参考,通过本地BLAST方法,利用TBtools软件在辣木转录组数据中挖掘MoGAD家族基因,采用PCR技术对其进行克隆,并通过生物信息学在线分析网站和分子对接技术分析MoGAD蛋白的理化性质和催化活性位点,采用实时荧光定量RT-qPCR技术分析MoGAD基因在不同组织中的表达水平。【结果】在转录组数据中挖掘到4个MoGAD基因并成功对其进行克隆,测序的CDS区长度分别为:1494、1212、1470和942 bp;MoGAD1、MoGAD3和MoGAD4蛋白不存在跨膜结构域,属于膜外蛋白。其中MoGAD2蛋白序列在第5~27和60~82氨基酸位置存在跨膜结构,此段序列编码蛋白为分泌蛋白;系统发育分析显示MoGAD1基因家族所在分支基因Motif数量最多;分子对接表明4个MoGAD蛋白存在磷酸吡哆醛(PLP)和L-谷氨酸结合位点,且每个蛋白有多个氨基酸残基与PLP,L-谷氨酸形成氢键;荧光定量分析显示MoGAD1和MoGAD2基因在嫩叶、成熟叶和花中的表达量显著高于MoGAD3和MoGAD4基因,但这些基因在茎中表达量较低,推测MoGAD酶主要参与辣木叶部位GABA的生物合成。【结论】本研究成功克隆了辣木的MoGAD基因,并分析其编码蛋白的理化性质及与底物结合的功能活性位点,为进一步研究MoGAD基因的功能提供了理论依据。

VIGS技术初步鉴定RgMLO6和RlMLO7基因对白粉病的负调控功能

为了探讨蔷薇科植物MLO基因在抗白粉病中的作用,研究应用病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)抑制了大花香水月季RgMLO6基因和长尖叶蔷薇RlMLO7基因的表达,随后接种白粉菌对这2个基因进行抗性鉴定.研究发现在VIGS载体转化植株叶片20 d后,RgMLO6和RlMLO7基因的相对表达量显著下降了80%~90%,沉默效果明显.分别对2个基因沉默后的嫩叶进行白粉病抗性鉴定,大花香水月季和长尖叶蔷薇的抗性水平较对照组均提高.显微镜观察白粉菌接种2个基因沉默后植株叶片中菌丝体的生长情况,整体表现出沉默植株叶表皮细胞上的白粉菌生长较对照组生长缓慢.结果表明RgMLO6与RlMLO7基因对蔷薇科植物的白粉病有负向调控作用.

月季白粉病及其抗性研究进展

由白粉病病菌引起的白粉病害是全球切花月季生产的第一大病害,同时也是庭院月季和盆栽月季的主要病害之一。目前,月季生产上主要通过反复施用化学药剂来预防和减少该病的发生,这样不仅增加了生产成本,还造成了环境的污染和破坏。对月季白粉病的症状、发病规律及发病条件、致病机制、防治措施、品种间抗病性差异以及抗病分子水平等方面的国内外研究情况进行概述,不仅可为花卉的白粉病相关研究提供理论依据,而且可为花卉的抗病分子育种提供科学参考。

云南川滇蔷薇天然居群表型多样性分析

基于居群生物学的基本原理和研究手段,对云南省分布的川滇蔷薇7个自然居群进行了相关调查,对它们的12个表型性状数据进行了统计与多样性分析.结果显示:这12个表型性状的F值在1.06~20.56,其中有8个性状在居群内和居群间均达到极显著或显著水平.这一结果表明其表型性状不论在居群内还是居群间,均具有变异多样性.它们的平均表型分化系数为63.00%,居群间变异(34.42%)大于居群内变异(20.29%),该结果表明川滇蔷薇表型变异的主要来源为居群间变异.对其表型性状和地理因子进行相关性研究,其结果显示:4个性状与地理因子呈正相关,其余8个性状与地理因子呈负相关.对其进行居群表型聚类分析,其结果显示:这些自然居群的表型变异与地理距离存在一定的相关性,大致依地理距离而聚类.

基于长尖叶蔷薇与大花香水月季转录组数据的MLO unigenes生物信息学及表达分析

在对长尖叶蔷薇和大花香水月季转录组测序的基础上,利用生物信息学方法,从其转录组数据中共获得23条MLO unigenes并对其进行了分析。结果显示它们之间的氨基酸数量、碱基数、分子量差异较小,多数为疏水性蛋白,平均亲水系数为-0.157~0.190,富含亮氨酸和丝氨酸。亚细胞定位主要分布于质膜中,包含5~9个跨膜结构;二级结构主要由α-螺旋组成。其中,等电点小于7的仅有1条,2条蛋白具有信号肽。这23条MLO蛋白具有15个长度在15~50个氨基酸间的保守基序。它们的系统进化关系分析结果揭示了MLO基因在长尖叶蔷薇与大花香水月季间具有较高的同源性和保守性。将这23条unigenes与来自于月季和拟南芥的MLO基因进行聚类分析,确定了6条可能参与抗白粉病的候选基因,对这6条候选基因进一步分析发现仅有2条unigenes符合MLO型白粉病基因的典型结构特征。最后,通过q RT-PCR试验验证,结果表明:这2条候选基因的相对表达量,在受到白粉病菌侵染后呈积极上调趋势。上述研究结果表明这2条候选基因很可能参与了寄主—白粉病菌的互作过程。

月季黑斑病及其抗性研究进展

月季黑斑病是世界性的病害,发生普遍且严重,较难防治,其病原菌为蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)。伴随着月季定向选育工作的开展,其病原菌易产生各类生理小种,导致月季的抗病性逐渐变弱;虽然喷施化学药剂的方法可以用来抑制病原菌的产生,但化学药剂的大量使用不仅增加了生产成本,还会导致生态环境的恶化。本文总结了月季黑斑病的发病症状、发病原因、防治方式、抗病性等,旨在为寻找新的抗黑斑病的月季新品种提供理论上的支持,同时为花卉抗病性的相关研究提供新的思路。

三七PnAAE41基因的克隆、表达分析及原核表达

草酰辅酶A合成酶参与了三七主要止血活性成分三七素的生物合成,研究三七草酰辅酶A合成酶基因(PnAAE41)的分子特征及表达特征,从而完善三七素生物合成途径以及成分积累调控机制等方面的研究。以三七为材料,在前期转录组研究基础上,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增获得1个三七AAE基因的cDNA全长。采用生物信息学方法分析其分子特性,通过qRT-PCR技术分析PnAAE41基因的时空表达特异性。通过异源表达探索PnAAE41蛋白最佳的诱导条件,随后以颜色反应作为定性研究的基础。序列分析结果表明,PnAAE41的开放阅读框长度为1572 bp,编码523个氨基酸,登录号为MW242343。系统进化分析显示,PnAAE41蛋白与拟南芥AtAAE蛋白亲缘关系最近。预测PnAAE41蛋白主要定位于细胞质膜上,不含信号肽序列,二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占大部分比例。qRT-PCR分析表明,PnAAE41基因主要在根和茎中优势表达。异源表达最佳诱导条件为0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),16℃诱导9 h,该蛋白对草酸具有催化作用。本研究结果为进一步深入研究AAE在三七素生物合成途径中的功能提供理论基础。

巧借问题链教学,破解“长篇”阅读难题

本文以《智取生辰纲》这样的长课文为例,紧扣教学目标,巧设导入式问题链、过程式问题链、迁移性问题链,在由简到繁、由易而难、由识及能中循序渐进、螺旋上升、环环相扣,高效地达成预定的教学目标,完成既定的教学任务。

蔷薇科植物MLO蛋白家族的生物信息学分析

MLO基因家族是一类重要的植物抗病基因,MLO蛋白的突变体对白粉病真菌表现出广谱抗性,且能特异性调控细胞死亡,利用自发的细胞死亡来应答发育或非生物刺激。为了分析蔷薇科植物MLO蛋白的结构特征、系统进化及潜在功能,本研究利用生物信息学方法对在Gen Bank中已登录的来自于蔷薇科的7个物种共计82条具有完整ORF的MLO基因进行了分析。分析显示这82条蛋白的氨基酸数量、碱基数、分子量差异较小,平均亲水系数为-0.191～0.253,绝大多数具有内含子结构;亚细胞定位主要分布于质膜中,包含5～8个跨膜结构;共有15个保守基序,长度在15～50个氨基酸之间。其中,等电点小于7的仅有1条,6条蛋白具有信号肽。系统进化关系揭示了这些物种间具有较高的同源性和保守性;将其与其它物种中已鉴定的MLO基因进行聚类分析,筛选出32个可能与抗白粉病相关的候选基因;进一步序列比对分析,发现仅有17条基因具有MLO型白粉病基因所有的典型结构。因此,本研究表明,所选用的82条蔷薇科MLO基因中,仅有17条基因可能参与寄主-白粉病菌的互作过程。本研究为进一步研究蔷薇科及其他植物MLO基因的抗病遗传机制提供了一些参考依据。

灯盏花R2R3-MYB转录因子基因家族鉴定与表达分析

R2R3-MYB转录因子是植物中存在最为广泛的一类,参与植物的生长发育和次生代谢的调控。该文基于灯盏花基因组数据,采用生物信息学手段鉴定灯盏花中的R2R3-MYB转录因子,并对其基因序列、结构、理化性质进行分析,聚类分析预测灯盏花中的R2R3-MYB转录因子的功能;同时基于激素处理的转录组数据,对R2R3-MYB转录因子响应激素的表达模式进行分析。从灯盏花的基因组中共鉴定108个R2R3型MYB转录因子,分别命名为EbMYB1~EbMYB108,位于9条染色体上;基因结构显示,除个别MYB基因外,基本都含有2~4个外显子;构建灯盏花与拟南芥MYB家族成员的系统发育树,将234个MYBs分为的30个亚族,5个拟南芥亚族单独聚类成不同亚家族分支,有4个分支单独由灯盏花MYB基因聚类;转录组数据显示各MYB基因在灯盏花不同组织和ABA、SA、GA外源激素处理不同时间的差异表达,有13个R2R3-MYB基因的转录没有发生明显变化,部分基因的表达模式随着激素处理时间的增加呈现上调或下调的趋势。该研究为参与灯盏花生长发育、逆境(激素)胁迫以及活性成分灯盏乙素积累相关的R2R3-MYB转录因子调控机制的研究提供了理论依据。

三七Expansin家族基因的鉴定及生物信息分析

扩展蛋白(Expansins)作为细胞壁松弛蛋白,是调控细胞壁延展的重要调节因子,参与调控植物细胞壁松弛、细胞膨大与胁迫反应等过程。本研究从三七基因组中共鉴定到24个Expansins基因,其中,EXPA亚家族成员17个,EXPB亚家族成员3个,EXLA亚家族成员1个,EXLB亚家族成员3个,系统进化分析显示它们与不同物种间有一定亲缘关系,表明该家族基因具有一定保守性。通过分析6个生长时期的三七主根中Expansins家族基因表达热图,发现Pn EXP15、Pn EXP17、Pn EXP22、Pn EXP24在三七主根发育过程中显著高表达,可能参与调控细胞壁松弛来调节三七主根的发育,以促进三七主根的膨大。本研究为深入探索三七扩展蛋白家族基因的功能、物种间的进化关系和三七分子育种提供科学参考依据。

假地豆碳糖基转移酶基因的克隆、生物信息分析及原核表达

碳糖基转移酶(CGTs)是植物中黄酮碳苷生物合成途径中关键酶,具有催化黄酮类底物生成黄酮苷类化合物的功能。本研究对药用植物假地豆(Desmodium heterocarpon(L.)DC.)中黄酮碳糖基转移酶基因(DhCGT1)进行克隆、生物信息学分析、异源表达和蛋白纯化。结果表明DhCGT1基因全长1446 bp,含481个氨基酸,DhCGT1蛋白的相对分子质量为53.55 kD,含47个极性氨基酸残基,51个非极性氨基酸残基,等电点(pI)为6.44,分子式CHNOS,脂溶系数为88.38,平均疏水性为0.822,半衰期为30 h。不稳定指数为47.80,属于不稳亲水蛋白。DhCGT1蛋白是非分泌蛋白,没有信号肽识别功能,并且该蛋白不存在跨膜区,亚细胞定位预测分析结果显示DhCGT1蛋白位于质膜上。经多序列比对和亲缘关系分析显示,DhCGT1基因编码的氨基酸序列与大豆(Glycine max)和豇豆(Vigna unguiculata)序列相似度高达67.38%。作为黄酮碳苷的生物合成过程中的关键酶,CGTs催化并生成了多种具有重要活性的黄酮碳苷类化合物。本研究首次成功克隆、异源表达并纯化了山蚂蝗属假地豆植物中的DhCGT1基因,这为进一步研究DhCGT1基因功能及假地豆中黄酮碳苷合成途径的分子机制提供基础。