宏基因组来源高活性酯酶的鉴定及其酶学性质表征

土壤中大量的非培养微生物是新酶发现的重要资源。该研究利用功能宏基因组学策略筛选获得高活性酯酶,并对其进行鉴定分析。采用三丁酸甘油酯平板法对土壤微生物宏基因组文库中具有酯酶活性的克隆进行筛选,获得高活性的阳性克隆,通过生物信息学分析和生化实验对酯酶的酶学性质进行研究表征。获得一个比活力高达(3 957±3) U/mg的酯酶AesZF899,该酯酶为不含信号肽的酯酶第四家族胞内酯酶,蛋白大小34 kDa,与来自Afipia sp.P52-10中未表征的α/β水解酶(GenBank登录号为WP_034470467.1)一致性达76.43%。AesZF899的最佳底物为对硝基苯乙酸酯,酶反应的最适pH值和最适温度分别是9.0和40℃。AesZF899在30℃温育8 h后仍可保持初始活性,在35、40℃分别温育7和4 h后仍可保持50%的活性,在反应温度大于80℃后酶活性丧失。终浓度10 mmol/L的Fe3+可以增强酶活性,而终浓度10 mmol/L的Na+、Li+和Mg2+有较强的抑制作用。体积分数为1%二甲基亚砜可以增强酶活性,异戊醇也对酶活性有一定的促进作用。

土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因tet(64)的表达及功能鉴定

[目的]本文旨在研究土壤宏基因组来源的新型四环素破坏酶Tet(64)的耐药机制并分析tet(64)的基因环境,为tet(64)基因的传播及抗生素和佐剂的研发奠定基础。[方法]利用体外生化反应验证Tet(64)降解四环素的功能,通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析降解产物,结合序列比对、系统发育树构建、分子对接等生物信息学方法推测Tet(64)中与四环素结合的重要氨基酸残基,解析Tet(64)的耐药机制和tet(64)基因的水平转移风险。[结果]MQ776克隆的序列分析发现tet(64)上游存在IS1插入序列,暗示tet(64)基因具有潜在的水平转移风险。Tet(64)属于黄素依赖型单加氧酶,与首次发现的四环素破坏酶Tet(X)仅有18.93%的序列一致性,与最近发现的一系列土壤来源四环素破坏酶Tet(47)—Tet(56)也只有70%左右的序列一致性。SWISS-MODEL三维建模发现Tet(64)与土壤来源的Tet(50)具有相似的结构,包含1个四环素结合域、1个FAD结合域以及连接上述2个结构域的2个α-螺旋。体外生化试验发现Tet(64)降解四环素后产生了2个特异产物,m/z均为461.0,与Tet(X)催化产物一致。推测反应中四环素C11a位点被羟基化,破坏了C11和C12组成的β-二酮区域,导致四环素不能螯合镁离子而失去抗菌活性。[结论]鉴定了土壤来源的新型四环素破坏酶Tet(64)的四环素降解功能,初步解析了Tet(64)的耐药机制。

异戊烯基转移酶N端截短强化异戊烯基柚皮素合成

8-戊烯基柚皮素(8-prenylnaringenin,8-PN)是一种强有效的雌激素,具有很高的药用价值,同样也是多种异戊烯基黄酮的前体。微生物合成8-PN主要面临异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化活性较低以及前体供给不足等问题,严重阻碍了8-PN在微生物体内的高效合成。文中以苦参(Sophora flavescens)来源的SfN8DT-1为对象,研究如何实现更高效的柚皮素异戊烯基化反应。结构预测显示,SfN8DT-1主要由9个α-螺旋和8个环的主体,以及一个近120个氨基酸的长侧链组成。将侧链不同位点序列截断的SfN8DT-1在酿酒酵母中表达,发现截短至K62位点时8-PN产量最高,将该蛋白命名为SfND8T-1-t62。SfN8DT-1-t62与柚皮素和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)进行分子对接,发现K185是一个潜在的关键位点。对底物0.5 nm范围内的氨基酸进行丙氨酸扫描突变,突变体K185A对底物的亲和力下降,表明K185是一个潜在的关键催化位点。模拟饱和突变表明,突变体K185W对配体的亲和力增强,而K185饱和突变后8-PN产量显著下降,说明K185对SfN8DT-1的功能至关重要。另外,结合甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径关键基因的强化,8-PN产量达到31.31 mg/L,说明DMAPP的供给也是8-PN合成的关键因素。最后,将产量最高的菌株在5 L发酵罐中进行发酵,发酵120 h后8-PN产量达到44.92 mg/L,是目前报道的最高水平。

我的战“疫”日记:下沉社区这七天

我是国家粮食和物资储备局湖北局规划建设处的吕云斌,中共党员,家住武汉市武昌区。2019年全年在国家局挂职,2020年元月18日从北京回武汉过年。没成想,此时此刻,在武汉,一场抗击新冠肺炎的战役已悄悄展开;随后从元月20日开始,这场战役在全国范围内迅速展开。在这场战役中,我有幸在武汉主战场参与作战,为抗击疫情贡献自己的力量。