耻垢分枝杆菌MSMEG_4259的基因组维护功能研究

MSMEG_4259基因及其同源基因广泛存在于分枝杆菌属中。蛋白序列分析显示,MSMEG_4259包含DEDDh核酸外切酶结构域以及一个类似UvrC的核酸内切酶结构域,提示其可能参与DNA修复。为了探究MSMEG_4259的生理功能,本研究利用同源重组方法在耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)构建了MSMEG_4259基因敲除(ΔMs4259)菌株,并采用波动试验测定菌株在对数生长期以及H2O2处理后的利福平耐药突变频率。结果显示,ΔMs4259菌株的利福平耐药自发突变频率较野生型菌株升高1.9倍(P<0.05),该表型能够通过表达MSMEG_4259回补。测定耐药突变菌株rpoB基因的耐药决定区域序列,发现ΔMs4259菌株的A:T>C:G突变概率较野生型菌株上升约10倍,有研究证明该突变谱是DNA氧化损伤的常见突变。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)结果显示,野生型菌株的MSMEG_4259表达在H2O2处理后上调约7倍,提示该基因在转录水平参与了氧化压力应答。野生型菌株与ΔMs4259菌株在氧氟沙星、叔丁基过氧化氢和紫外线处理下的存活率无显著差异,提示MSMEG_4259不参与耻垢分枝杆菌对上述DNA损伤剂的耐受。本研究初步揭示了MSMEG_4259参与耻垢分枝杆菌基因组维护的生理功能、突变谱及转录调控等特性,为进一步研究其同源基因在结核分枝杆菌致病和耐药中的作用机制奠定了基础。

结核分枝杆菌espK基因G-四链体核酸序列多态性与表达调控功能研究

DNA的G-四链体(G-quadruplex,G4)是由富含串联重复的鸟嘌呤(guanine,G)的核酸序列折叠形成的四链体螺旋结构,目前认为其与基因表达调控和基因组稳定性有关。已有研究表明,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的esp K(Rv3879c)是构成ESX-1分泌系统的一个重要元件,其蛋白序列具有串联重复的GTPITP氨基酸序列多态性。本研究经核酸序列比对分析,确定该氨基酸序列多态性区域对应的模板链上存在G4序列,且该G4序列仅存在于结核分枝杆菌复合群。通过比对结核分枝杆菌临床分离株esp K基因的核酸序列,发现esp K基因的高频率G1573C突变位于G4序列。为研究该G4结构及基因表达调控功能,首先利用圆二色谱检测其核酸片段在钾离子存在条件下的光谱学特征,证实其可在体外形成具有顺式平行结构特征的G4,同义点突变G4会使其结构稳定性下降。采用重叠聚合酶链反应(overlapping polymerase chain reaction,overlapping PCR)构建含有G4突变的esp K表达质粒,获得重组表达菌株。通过实时定量PCR测定esp K重组表达菌株中基因转录水平变化,发现同义点突变G4后,其基因转录水平比野生型esp K重组菌株提升1.5倍(P<0.05)。此外,临床分离株中esp K出现的高频率G1573C突变会破坏G4结构,但蛋白免疫印迹检测结果显示esp K G1573C突变导致Esp K蛋白表达水平上升。以上结果提示,esp K的G4结构具有表达调控功能,该G4区域的序列多态性可能通过影响Esp K表达水平来调节ESX-1分泌系统的活性。

分枝杆菌RpsI序列差异对核糖体结构与功能的影响

核糖体结构存在动态调控,其变化与细菌发育、环境适应等过程密切相关。使用NCBI BLAST比对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)核糖体蛋白RpsI、RpmI和RpmJ与耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)相应蛋白的氨基酸序列,发现RpsI N端氨基酸序列存在较大差异。为了探究该N端序列差异对核糖体结构与功能的影响,将表达有结核分枝杆菌rpsI基因(rpsI_Rv)的质粒整合至耻垢分枝杆菌基因组中,并利用同源重组的方法敲除耻垢分枝杆菌rpsI基因,以此构建重组菌株。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)结果表明该重组菌株构建成功。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于16℃可诱导表达RpsI_Rv。用纯化的RpsI_Rv制备特异性多克隆抗体,其效价为1600000。反转录PCR和蛋白质印迹法(Western blot)显示rpsI_Rv在重组菌株中成功表达。测定重组菌株与空载对照菌株在不同温度下的生长曲线,该重组菌株在不同温度下的生长速率未发生改变。采用通用液体倍比稀释法测定作用于核糖体不同位点的5种抗生素最小抑菌浓度(MIC 90),重组菌株对阿米卡星(作用于核糖体小亚基A位点的抗生素)的敏感性升高,提示分枝杆菌RpsI序列差异导致核糖体小亚基A位点附近的结构发生改变,这为分枝杆菌核糖体结构与功能的机制研究提供了数据。

结核分枝杆菌H37有毒株与无毒株的代谢相关基因pabB和lpdA启动子活性分析

【目的】通过分析结核分枝杆菌无毒株H37Ra的全基因组序列,并与H37Rv基因组序列比较,发现pabB和lpdA预测的启动子区发生了突变。我们利用报告基因,确认启动子突变与其基因转录水平的关系,探索结核分枝杆菌H37Ra毒力丧失的内在原因。【方法】利用生物信息学方法预测这两对基因的启动子区,采用PCR技术克隆这两对基因的启动子,与分枝杆菌启动子探针载体pMC210相连,DNA测序证实连接片段正确后,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155。利用Quantitative Real-Time RT-PCR检测报告基因lacZ转录水平的差异,进一步验证这两对基因启动子的突变对相应基因转录水平的影响。【结果】Quantitative Real Time PCR检测结果显示H37RapabB启动子活性是H37Rv pabB启动子活性的6倍(p<0.05),而H37Rv lpdA启动子的活性是H37RalpdA启动子的2倍(p<0.05)。【结论】pabB,lpdA的启动子在H37Ra中的突变对其启动子的活性产生了影响,其中lpdA启动子的突变可能与结核分枝杆菌H37Ra的毒力丧失有关。

肝X-受体激动剂马尾藻甾醇的体外抗结核活性研究

目的评价马尾藻甾醇及其24-差向异构体的抗结核活性。方法运用半制备高效液相色谱法(HPLC)分到马尾藻甾醇异构体,核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定异构体的化学结构;采用倍比稀释法测定化合物对结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)、单独使用及联合用药的杀菌作用;采用对硝基乙酸苯酯(PNPA)法评价化合物对芳胺N-乙酰基转移酶(arylamine N-acetyltransferases,NAT)的抑制作用,并使用ledock_go软件进行分子虚拟对接实验。结果获得24S-和24R-马尾藻甾醇;马尾藻甾醇、24S异构体和24R异构体对M.tuberculosis的MIC值分别是25、12.5μmol/L和>100μmol/L,对NAT蛋白的抑制率分别为45.27%±2.49%、46.95%±8.30%和29.20%±5.30%。马尾藻甾醇和24S异构体还能增强氧氟沙星的杀菌作用。从数值上看,24S异构体活性强于24R异构体,分子对接实验提示24S异构体与NAT蛋白之间的结合比24R异构体更牢固。结论马尾藻甾醇及其24S异构体在体外对结核分枝杆菌具有杀菌作用,可能与细菌胆固醇代谢有关,尚待深入研究。

细菌药物耐受

细菌药物耐受(Drug tolerance)是指在没有发生耐药突变的情况下细菌耐受抗生素杀菌的能力,表现为细菌群体难以或不能被杀菌型药物清除。细菌药物耐受的调控机制包括群体异质性和压力应答两种途径。药物耐受性的本质是细菌通过调控或遗传突变的方式改变生理代谢状态,从而抵制药物引起的细胞死亡途径。比如,处于缓慢生长或生长停滞生理状态的细菌往往能够抵抗药物的杀菌作用。临床研究发现细菌药物耐受是导致持续性感染疾病迁延难愈、复发率高的病原学机制之一。同时,研究证明耐受性的形成是细菌耐药性(Drug resistance)产生的进化途径之一。因此,揭示细菌药物耐受的机制将有助于人们深入了解抗生素的杀菌机理,以及细菌耐药性形成的适应性进化机制,并为新型杀菌药物以及药物增效剂靶标的发现和抗生素合理使用策略的开发奠定理论基础。