优化sgRNA序列提高斑马鱼CRISPR/Cas9系统的突变效率

CRISPR/Cas9系统介导的定点突变已经在多种模式生物中实现,其中提高sgRNA的编辑效率是关键性因素。通过分析斑马鱼Danio rerio sgRNA序列特征,优化现有sgRNA设计原则,提高了CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中的切割效率。根据现有的sgRNA设计原则,利用软件CHOPCHOP和Benchling对斑马鱼内35个基因设计157个sgRNAs并分析其序列特征对基因突变效率的影响。结果表明,CRISPR/Cas9系统对斑马鱼产生高效靶向突变的sgRNA序列具有明显的碱基偏好性。当靶点序列和靶点种子序列的GC含量为50%~60%、紧邻靶点3’端的前间区序列邻近基序可变碱基为C、Cas9蛋白复合体的切割位点碱基对为AC时,靶点序列具有较高的切割效率。同时,对6个已发表数据集的959个sgRNAs的序列特征进行重新分析,得到了类似的结果。优化的sgRNA设计原则,能显著提高靶基因的突变效率。