靶向UL27shRNA抑制Ⅱ型单纯疱疹病毒在HEK293细胞中的复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计原则,针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type2,HSV-2)的UL27基因序列保守区域筛选设计、合成4条干扰靶序列并构建表达UL27序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pGPU6/GFP/Neo.通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞(human embryonic kidney 293 cell)再接种HSV-2.采用实时荧光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR)技术检测UL27各组的mRNA转录水平,终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度,四甲基偶氮唑盐(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,Western印迹法检测蛋白表达效果.结果显示,UL27shRNA75组对UL27基因mRNA表达抑制效果最佳,同时能显著抑制感染细胞的CPE(cytopathic effect,CPE),降低上清液中的病毒感染滴度,提高细胞的生存率,抑制UL27基因的蛋白表达.提示本研究构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27表达载体能在细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL27基因表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制.

UL27、UL29基因shRNA表达载体的构建及对HSV-2的干扰效应研究

探讨Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)UL27、UL29基因联合靶向siRNA对HSV-2复制的影响。构建UL27、UL29基因的siRNA的重组表达载体并转染293细胞,通过实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹方法检测UL27、UL29基因的表达,终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度,MTT法检测细胞的存活率。结果显示:(1)成功构建短发夹RNA(shRNA)重组表达载体。(2)转染后48 h,与空白组(空载体)相比,UL27 shRNA75组对UL27基因mRNA的抑制率为75.17%(P<0.05),UL29 shRNA1461组对UL29基因mRNA抑制率为66.08%,具有显著性差异(P<0.05)。UL27 shRNA75联合UL29 shRNA1461联合干扰组对UL27基因抑制率约为91.28%,UL29基因表达抑制率约为80.40%,与空白组比较具有显著性差异(P<0.05)。(3)终点滴定法结果显示单干扰组和联合干扰组可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度,与空白组比较差异性显著(P<0.01)。(4)Western blot检测目的基因蛋白,单干扰组与联合干扰组可不同程度降低目的基因蛋白的表达,其中UL27shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平,蛋白表达量明显减少,与单干扰组相比具有显著差异(P<0.05)。(5)经MTT法检测,UL27 shRNA75、UL29 shRNA1461、UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组的细胞存活率明显提高,差异有显著意义(P<0.05)。构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达载体,能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2 UL27、UL29基因表达,UL27、UL29联合干扰效率更高,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。

乙酰胆碱酯酶固定化条件的研究

以戊二醛为交联剂固定乙酰胆碱酯酶,考察缓冲液浓度、pH值对乙酰胆碱酯酶固定化的影响,用正交实验考察牛血清白蛋白和戊二醛的浓度、交互作用及3种固定化膜材料对固定化效率的影响。确定固定化载体壳聚糖膜、0.01%戊二醛、2%牛血清白蛋白、pH值6.0、0.05mol/L磷酸缓冲液为固定化优化条件,当抑制率标准采用50%时,该方法得到的固定化乙酰胆碱酯酶膜对敌敌畏的检测浓度达0.53μg/L。

shRNA靶向沉默HSV-2 UL54基因在HEK293细胞内的表达

根据乙型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆至真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中,经脂质体介导转染HEK293细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测HEK293细胞的存活率,RT-PCR检测UL54基因m RNA的表达,Western blot检测UL54基因编码蛋白质的表达,终点滴定法测定细胞上清液中的病毒感染滴度。结果显示,sh RNA1081能抑制UL54基因m RNA和蛋白质的表达,能显著降低子代病毒滴度,提高细胞的存活率。表明本研究构建的重组表达载体p GPU6/GFP/Neo-UL54 sh RNA能在HEK293细胞中表达,并抑制HSV-2复制。

医学研究生学位论文的答辩目的与策略

研究生论文答辩是检验医学研究生学位论文质量和培养质量的一种重要形式。根据近年来我国医学研究生在答辩中出现的问题,作者对研究生答辩的目的、答辩原则以及答辩中的问答技巧进行了初浅的探讨。

UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

目的利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响。方法采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率。结果转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率(P<0.01),增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达(P<0.01)。结论 pGPU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率。

羟基磷灰石层析法分离染色质中组蛋白的改进方法

报道了利用氯化钠梯度洗脱，通过羟基磷灰石柱层析，从染色质中分离组蛋白Ｈ１，组蛋白Ｈ２Ａ＋Ｈ２Ｂ和Ｈ３＋Ｈ４的一种改进方法．这一过程简单，采用温和的条件，能够提供较高纯度的各种组蛋白组分．

单纯疱疹Ⅱ型病毒UL29基因shRNA表达载体的干扰效应

目的:应用RNA干扰技术,针对单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV-2)UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体,观察其对HSV-2的干扰效应。方法:针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列,分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂质体转染到HEK293细胞。再将HSV-2接种到HEK293细胞中。采用终点滴定法检测病毒滴度,RT-PCR检测shRNA对转录水平的影响,Western-blot检测shRNA对蛋白质表达水平的影响。结果:终点滴定法结果显示UL29shRNA各组均可不同程度降低病毒感染滴度,与空白组(未转染重组表达载体)比较差异显著(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与空白组比较,4组抑制率分别为28.80%、59.95%、66.08%、36.27%,差异均具有显著性(P<0.05),shRNANC(不针对任何基因的序列)与空白组相比差异无显著性,其中以UL29shRNA1461组效果为最佳。Western-blot检测表明UL29shRNA各组ICP8蛋白表达水平比阴性对照组明显降低。结论:UL29shRNA能有效干扰HSV-2UL29基因的表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。

有机磷及氨基甲酸酯类农药残留检测研究进展

对近年有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的常规仪器分析和快速检测方法进行综述,比较各种方法的原理和优缺点,为农药残留检测研究与应用提供了参考。

靶向UL5小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒的抑制

背景:解旋酶-引发酶复合体是Ⅱ型单纯疱疹病毒进行复制的必需基因,UL5基因为Ⅱ型单纯疱疹病毒解旋酶-引发酶复合体的组成单位之一。目的:应用RNA干扰技术分析特异性小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因的干扰作用。方法:以Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因为靶目标,设计、合成5对特异性小干扰RNA。通过LipofeCtamine 2000脂质体将特异性小干扰RNA转染HEK293细胞。48h后行荧光定量RT-PCR检测UL5基因转录水平,终点滴定法测定干扰后病毒滴度,观察其干扰效果。结果与结论:小干扰RNA成功转染入细胞内。荧光定量RT-PCR结果显示,siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低靶mRNA表达,病毒滴度检测结果显示siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度,阴性对照组和siRNA374对病毒感染滴度无影响。针对UL5基因的有效小干扰RNA可以特异性降低Ⅱ型单纯疱疹病毒的复制水平。

基于实践的研究生医学实验动物学教学分析

研究生医学实验动物学课程是我校教学改革的中心对象之一,我们构建以研究生成长成才为主的培养机制,对教学内容、教学方法、考核评价机制三方面进行优化,积极探索以理论为指导,以实验为主导的教学改革的有效方法和途径。经过实践证明,教改提高了教学质量和效果,充分激发了学生的学习积极性和主动性,并建立了完善的考核体系,为今后的教学奠定了理论基础。

启发式教学在生理学实验教学中的应用

生理学实验是生理学教学中一个重要的组成部分。为了加强学生对生理学理论知识的理解和应用,培养学生积极思考和自学能力,初步建立科研思维,笔者在生理学实验教学中应用启发式教学方法,取得了良好的教学效果,为今后相关专业课的学习打下基础。

硕士研究生分子生物学实验技术教学改革初探

为提高硕士研究生分子生物学实验技术的教学质量,在教学内容的选择、教学方法的改进、实验设施的分配与利用、考核体制的建立等方面进行改革,取得了较好效果,为研究生今后的科学研究和实际应用奠定基础。

人绒毛膜促性腺素放射受体法的建立及其片段受体结合能力的研究

在获得高比活人绒毛膜促性腺素纯品的基础上，建立了检测人绒毛膜促性腺素的放射受体测定法。利用CNBr和TPCK—胰蛋白酶分别切割人绒毛膜促性腺素，用高压液相层析分离各种片段并检测其受体结合能力，发现特殊的绒毛膜促性腺素片段仍保留部分与受体结合的能力。这为研制封闭受体避孕药奠定了基础。

血浆、宫颈分泌物FFN的表达与自然临产的关系

目的 :探讨血浆、宫颈分泌物胎儿纤维结合素 (FFN)的表达与自然临产的关系 ,为临床预测自然临床时间提供客观、实用、易操作的检测方法。方法 :随机选择门诊 33～ 36 + 6周、住院待产 37～ 4 0周的孕妇各 5 0例作为研究对象 ,住院待产孕妇同时进行宫颈Bishop评分。结果 :血浆FFN值和宫颈分泌物FFN阳性率随孕周的增加明显升高 ,二者与自然临产孕周有密切关联 ,FFN较宫颈Bishop评分预测宫颈成熟更具客观指标。结论 :FFN是预测自然临产的客观标志 ,宫颈分泌物FFN检测以操作简单、价格适宜优于血浆FFN检测 。

PBL教学模式在医学院校研究生SPSS教改中的探索

探索PBL教学模式在医学院校研究生SPSS教学效果。采用单纯随机抽样的方法将2016级59名研究生随机分成两组(第一组29人和第二组30人)。教改内容分为定量资料的统计描述和定性资料的统计两部分,为消除学生本身因素的影响,在定量资料的统计描述教改中第一组为教改组,第二组为传统教学组。在定性资料的统计描述中,第一组变为传统教学组,第二组为教改组,教学内容完成后进行操作考试。结果显示:采用PBL教学和传统教学的操作考试成绩比较,在定量资料的统计描述中,教改组平均成绩为81.7241±6.78179,传统教学组为73.1500±6.67619,差异显著(t=4.894 P=0.000);在定性资料的统计描述中,教改组平均成绩84.3000±6.67677,传统教学组76.0690±6.58695,差异显著(t=4.765 P=0.000)。结论:采用PBL教学模式的学生SPSS操作考试成绩明显优于采用传统模式。

蜂毒明肽对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病模型的体内外作用研究

目的初步探讨蜂毒明肽对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病(AD)模型的体内外干预作用。方法侧脑室注射Aβ_(25-35)构建AD小鼠模型。连续5 d腹腔注射0.2 mg/kg蜂毒明肽。小鼠跳台测试认知功能,免疫组化检测海马CA1区Aβ_(1-42)表达。10μmol/L Aβ_(25-35)诱导海马神经元构建细胞损伤模型。100 nmol/L蜂毒明肽干预24 h后,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33342染色检测细胞凋亡率,全细胞膜片钳技术检测海马神经元小电导钙激活性钾通道介导的中间后超极化电流(I_(mAHP))。结果动物实验显示,与模型组比较,蜂毒明肽组小鼠学习成绩错误次数减少,潜伏期延长、记忆成绩错误次数减少,Aβ_(1-42)表达减低(P<0.05)。细胞实验显示,蜂毒明肽组较模型组海马神经元存活率增加,凋亡率下降,I_(mAHP)减小(P<0.05)。结论蜂毒明肽对Aβ_(25-35)诱导的AD模型具有保护作用,其机制可能与减少Aβ表达,降低I_(mAHP)有关。

PBL结合仿真技术在医学研究生分子生物学教学中的应用初探

分子生物学是当今高校生物类及医学各专业研究生必修的课程,它在培养研究生的创新意识及科研能力中起着重要的作用。本文作者结合多年的相关课程教学经验,针对当前研究生在分子生物学理论及实验教学中存在的问题进行了一系列改革。通过引入PBL教学模式,合理设计多个专题以学生为主体转变教学模式,使学生的学习由被动转为主动,加强了学生的对理论知识的掌握及运用能力。在实验教学引进仿真技术结合传统的实验教学模式,部分解决了分子生物学技术实验教学中存在的理论知识抽象难于理解、操作过程复杂耗时等难题,取得了较好的效果。

UL27基因shRNA表达载体对293细胞转染效率的优化

旨在优化Lipofectamine2000试剂介导UL27基因重组质粒p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA转染HEK293细胞的条件,为研究UL27基因重组质粒对HSV-2的干扰作用奠定基础。用Lipofectamine2000试剂介导p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA重组质粒转染293细胞,采用流式细胞仪检测不同的转染时间下的转染效率,同时荧光显微镜和流式细胞仪检测不同比例条件下的转染效率,MTT法检测细胞的存活率。在质粒与转染试剂复合物的配比为0.8μg∶2μL,转染48 h,转染效率最高并且对细胞毒性最小。优化p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA转染293细胞的条件,提高了转染效率。

shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应

目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度。结果与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71%,使蛋白表达减少71.81%,并且病毒滴度也明显降低(P<0.05)。结论构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上干扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制。