程序性死亡受体配体-1 B细胞表位预测与分析

目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等,结合PD-L1的二级结构与其柔性区域对PD-L1的优势B细胞表位区段进行综合分析,建立3D模型,结合功能定位,进一步运用抗原指数分析预测,将人与小鼠的B细胞表位进行对比分析,并与多种实验动物进行同源性分析。结果:人和小鼠的PD-L1均为一型跨膜蛋白,均由290个氨基酸残基组成,相对分子质量均为33 kDa。人和小鼠PD-L1的胞外段分别位于N端的19~238和19~239。经综合分析,与PD-1、PDL1结合相关的人和小鼠的B细胞优势表位可能分别位于其氨基酸序列N端的41~46、60~63、71~75和40~48、58~63、72~88区段,即KFPVEK、EDKN、EEDLK和RFPVERELDL、EKEDE、EDLKPQH肽段;同源性分析显示包含本研究所预测的表位的氨基酸序列在多种动物之间高度保守。结论:将生物信息学预测B细胞表位的方法与3D模型建立及功能定位的方法相结合,筛选出人和鼠各3条与PD-L1功能区相近的优势B表位,为阻断PD-1和PD-L1结合的拮抗剂的研究提供了理论基础。

小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性

目的:制备小鼠PD-1胞外区(mPD-1)与其配体PD-L1胞外区(mPD-L1)原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法:通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核表达系统制备相应的重组蛋白并纯化,通过Western blot进行鉴定;将纯化的mPD-L1蛋白免疫健康日本大耳白兔制备兔多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot分析得到的多克隆抗体的效价和特异性,并且将该多克隆抗体作为免疫荧光的阳性对照。最后应用ELISA和免疫荧光验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的亲和性。结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示原核表达的重组蛋白与预期大小一致,mPD-L1和mPD-1分别为25 kDa和40 kDa。经mPD-L1蛋白免疫后的日本大耳白兔能够产生特异性抗体,抗体效价在免疫后第6周达到高峰,Western blot检测结果显示多克隆血清可特异性识别mPD-1。ELISA结果表明,原核表达的mPD-L1蛋白能够和mPD-1蛋白结合,实验组OD450值明显高于对照组。免疫荧光结果显示,在小鼠PD-L1阳性细胞B16(小鼠黑色素瘤细胞株)的胞膜区出现绿色荧光团块。结论:利用原核细胞表达并纯化后获得mPD-L1和mPD-1蛋白,并在体外成功验证了mPD-L1和mPD-1之间的结合特性,为后期利用mPD-1和PD-L1的生物学特性研究提供了基础。

PD-L2蛋白B细胞表位预测及其与PD-1结合的三维结构分析

目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和Jameson-Wolf抗原指数以及Emini表面可及性方案等,预测结果被用以对PD-L2的优势B细胞表位区段进行多方面分析。运用抗原指数分析,预测PD-L2的B细胞表位。使用BLAST分析人源PD-L2与小鼠PD-L2的同源性,将人源PD-L2的B表位与小鼠PD-L2的序列进行匹配。将与人源PD-L2表位匹配的序列在小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合模型上定位,对其立体结构进行模拟,进一步直观地分析B细胞表位与蛋白结合位点的关系。结果:PD-L2的全长氨基酸序列共含有273个氨基酸,相对分子质量为31 k Da的可溶性蛋白;经综合分析,其B细胞优势表位可能为氨基酸序列N端的60~72、93~97、133~139、164~171区段。模拟立体结构分析显示表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PDL2的结合区域内。结论:利用生物信息学预测发现PD-L2的优势B细胞表位中,60~72、93~97、133~139、164~171区段为PD-L2的B细胞表位,其中表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PD-L2的结合区域内。可为PD-L2抗体设计和研究提供理论基础。

EB病毒LMP1 C端重组蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)C端(187～386)的原核表达蛋白及其多克隆抗体并检验其生物学特性。方法:选择LMP1C端的基因并进行原核密码子优化,全基因合成pET21a(+)/EBVLMP1C端重组质粒,并转入E.coliBL21(DE3)感受态细菌进行诱导表达重组蛋白,利用His标签提取纯化重组蛋白并经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定。将纯化的LMP1C端重组蛋白免疫日本大耳白兔,获得多克隆抗体,分别采用ELISA、Westernblot及免疫荧光方法对兔多克隆抗体进行分析。结果:EBVLMP1C端(187～386)重组蛋白可经原核表达系统表达;通过免疫兔获得了特异性的多克隆Ig G抗体;制备的兔多克隆抗体可特异性结合并识别LMP1C端蛋白。结论:EBVLMP1C端重组蛋白免疫原性较强,制备的兔多克隆抗体效价高、特异性强。

CEA阳性细胞系的鉴定及其荷瘤小鼠模型建立

目的鉴定HT-29、MKN-45及Hela细胞系中CEA的阳性表达率,并分别建立3个细胞系对应的荷瘤小鼠肿瘤模型,分析其成瘤特性。方法采用RT-PCR、western blot检测HT-29、MKN-45及Hela细胞中的CEA表达情况,采用免疫荧光实验检测3株细胞系的CEA蛋白表达情况。以2×10^(7)/ml细胞浓度接种小鼠建立动物模型,观察荷瘤小鼠生长情况并记录肿瘤大小,对其成瘤特性进行分析。结果CEA蛋白在HT-29、MKN-45细胞中表达,而在Hela细胞中不表达,CEA蛋白主要存在于细胞的胞质中。MKN-45荷瘤小鼠的成瘤潜伏期为(6.3±1.5)d,HT-29成瘤潜伏期为(6.0±2.2)d,而Hela细胞的成瘤潜伏期为(10.0±1.6)d。MKN-45、HT-29细胞的成瘤时间明显短于Hela细胞。结论CEA在HT-29、MKN-45细胞中表达,而在Hela细胞中不表达。成功建立了3株细胞对应的荷瘤小鼠模型,为CEA阳性肿瘤的发病基础以及治疗提供了动物模型基础。