藤茶黄酮及吐温80饲用于肉羊生产的研究进展

自2020年7月1日中国饲料禁抗令全面实施以来,探寻抗生素类饲料添加剂的替代品成为畜牧业研究的热点。据此,该文全面收集了国内外关于莫能菌素、藤茶黄酮和吐温80在肉羊或家畜生产中的相关报道,初步整理分析其对家畜生产性能、血液生化指标、屠宰性能、相关代谢指标的影响,旨在为探索莫能菌素等抗生素类的替代品在肉羊生产中的应用提供一定的理论依据。

云南省猪圆环病毒2型遗传进化分析

【目的】调查猪圆环病毒2型(PCV2)在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南PCV2毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用PCR方法对云南省11个地区783份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2病原学检测,对6份PCV2阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用DNAStar软件比对分析全基因和ORF2氨基酸序列,使用MEGA软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的PCV2阳性率为48.73%;共测得6株PCV2全基因组序列,其中5株为1 767 bp, 1株为1 768 bp;经遗传发育分析可知,有PCV2a亚型2株、PCV2b亚型2株、PCV2d亚型2株;6株PCV2毒株同源性在94.6%~99.9%之间,与GenBank数据库中20条参考株同源性在91.4%~99.8%之间;6株PCV2亚型的ORF2都有其典型的氨基酸位点,PCV2a毒株在第80(V80L)氨基酸位点突变为与PCV2(b/d)一致,PCV2b毒株在59(R59K)、63(K63R)、190(A190T)等氨基酸位点突变与PCV2d一致。【结论】PCV2在云南猪群中普遍存在,以PCV2a、PCV2b和PCV2d这3个基因亚型共存为主,且PCV2(a/b)有向PCV2d突变的趋势,荷斯坦奶牛尚未感染PCV2。

稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用

【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro)进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验(IFA)观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度(TCID50)。【结果】试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。

云南省部分地区规模猪场猪伪狂犬病流行病学调查

为调查云南省规模化猪场猪伪狂犬病流行情况,2016—2017年分别采用ELISA和PCR检测技术,对从云南省9个地区54个猪场采集的6 555份全血和381份疑似病料进行了血清学和病原学检测。抗体检测结果显示:血清样品的gB抗体阳性率为88.7%,gE抗体阳性率为13.5%;楚雄市的gB抗体阳性率最低(78.5%),但gE抗体阳性率(野毒感染率)最高(21.8%);大理市的gB抗体阳性率最高(95.1%),但野毒感染率最低(6.0%);第2季度野毒感染率最高,为20.3%。病原学检测结果显示:疑似病料病原检测平均阳性率为23.1%,其中母猪、保育猪和育肥猪分别为28.8%、23.4%和20.4%,公猪精液为25.0%,流产胎儿和仔猪为22.3%;玉溪市的病原检出率最高(52.6%),德宏市最低(16.4%);各季度的病原检出率无明显差异。调查结果表明,猪伪狂犬病在云南省仍有流行,部分地区较为严重,尤其是玉溪、宣威和西双版纳等地区;应重点加强对母猪、保育猪、仔猪以及公猪精液的防控;加强伪狂犬病免疫,提高gB抗体阳性率,有助于预防野毒感染。

云南省部分猪场病料猪圆环病毒3型PCR检测及克隆测序

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在云南省的流行及遗传进化情况,2020年10—12月收集云南省部分猪场疑似病料共24份,采用PCR方法进行PCV3病原检测;选取PCV3阳性扩增产物进行克隆测序,并将测序结果与16株国内外参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果显示:24份病料样品中检出阳性5份,阳性检出率为20.8%;克隆出的阳性扩增产物(YNJS-2020)ORF2核苷酸序列和国内外参考毒株的同源性较高,为97.4%~98.9%,其中与西班牙毒株MF80572000同源性最高,与安徽14-201611毒株同源性最低。结果表明,云南省存在PCV3流行,且流行毒株与国内外其他毒株遗传关系较近,但也有一定差异。结果提示,云南省应加强对PCV3的监测及其流行的控制,避免PCV3大面积流行。本研究为云南省PCV3基因型分析和疫苗研究提供了一定的数据基础。

一株仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

从红河州某猪场采集腹泻仔猪粪便及肛门拭子样品,进行细菌的分离培养、生化试验、16S rDNA扩增、测序及序列同源性分析,确诊分离菌为大肠杆菌。致病性试验和药敏试验表明,分离菌对小鼠有致病性,对7种药高敏、8种药中敏、12种药有耐药性。为该猪场仔猪腹泻的临床防控提供了依据。

四猪场PRV-gE抗体调查分析

猪伪狂犬病是引起猪繁殖障碍的重要疫病,采用ELISA检测方法,2019年4月对4个猪场的217份血样进行PRV-gE抗体检测。4个猪场的种公猪或母猪均检出了阳性,说明中小型猪场应加强种猪的管理,特别是引种时必须对引进的种猪进行采样检测,避免从阳性猪场引进种猪。4个猪场gE抗体总阳性率为25.81%,比往年阳性率高,说明部分猪场伪狂犬病gE感染有增高趋势,应引起云南省养猪行业相关人员重视。

云南PCV2d毒株昆明小鼠动物模型的建立

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)对昆明小鼠的致病性和细胞因子IL-10、TNF-α和IL-12在PCV2感染后的表达。以SPF昆明小鼠为动物模型,通过腹腔注射感染云南PCV2d毒株,攻毒后第7、14、21、28、35天对小鼠肝、脾、肺等进行病理切片观察,实时荧光定量PCR检测小鼠各组织PCV2含量及IL-10、TNF-α和IL-12 mRNA表达水平。结果显示,PCV2在小鼠肺、脾和淋巴结中含量较高,且于攻毒后第14~21天达最高,心、肝和肾中含量相对较少;攻毒组小鼠出现肺出血,脾和淋巴结出血、肿大,病理切片观察显示,各组织出现不同程度的损伤;此外,感染PCV2后小鼠肺、脾和淋巴结中IL-10、TNF-α和IL-12 mRNA表达呈一定的消长规律,其中IL-10和TNF-αmRNA表达高于对照组,IL-12 mRNA表达普遍低于对照组。上述结果表明,本试验成功建立云南PCV2d毒株感染SPF昆明小鼠动物模型,为研究云南PCV2d毒株的致病机理及免疫抑制机理奠定了基础。

2017年云南地区部分猪场主要疫病病原及血清学检测与分析

为了了解云南部分地区猪场2017年主要疫病的流行情况,试验采用ELISA、RT-PCR及PCR方法对云南省10个市（州） 21个猪场送检的3 143份血样及205份病料进行6种抗体和4种抗原检测。结果表明：猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病gE病毒、猪伪狂犬病gB病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫O型病毒抗体监测阳性率分别是84.73%、73.56%、13.78%、78.87%、96.95%、91.05%,猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病gE病毒、猪圆环病毒2型（除猪口蹄疫O型病毒）的阳性检出率分别是4.00%、18.31%、17.95%、17.86%。不同季度、区域猪群的抗体阳性率有差异,猪瘟病毒免疫抗体总体效果较好,但仍有猪瘟散发现象;猪蓝耳病、猪圆环病毒2型感染仍然普遍;猪伪狂犬野毒感染阳性率有上升趋势;猪口蹄疫O型病毒的抗体水平很好。说明这猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病仍然是防控的重点。

10株猪流行性腹泻病毒云南分离株的S基因克隆及分子特征

自2013年来,猪流行性腹泻病(PED)的暴发给云南省养猪业带来严重的经济损失。本研究对2018年来自云南4个地区的42份病料中分离出的6株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的部分S基因进行扩增,并结合在2013年所分离到的来自云南4个地区的4株PEDV流行株,进行分子特征和遗传进化分析。结果显示:这2年的分离株和CV777株相比,2018年分离株的核苷酸和氨基酸突变位点增加了12个和7个,且有3个丝氨酸突变都是在COE结构域(69、101和146)。系统发育分析表明,2018和2013年分离株的核苷酸和氨基酸的同源性为95.6%～98.8%,95%～98.8%;分别与CV777株相比,核苷酸和氨基酸的同源性差异较小(94.9%～95.5%和92.7%～95.4%;94.5%～95.2%和93.4%～94.2%),亲缘关系都较远。2013年的分离株主要分布在G2b亚群,而2018年的分离株主要分布在G2a和G2c亚群,具有遗传多样性。N-糖基化和磷酸化位点预测分析显示,在216位上预测的N-糖基化位点由NSSI→NSSF,尤其是COE结构域中的丝氨酸取代而导致其可预测磷酸化。这些变异很可能会影响其抗原性和疫苗效果,导致PEDV控制效果不好。本研究阐明了云南部分地区PEDV流行毒株的分子流行病学和遗传特征,为该地区PED的防控奠定理论基础。