甜菜夜蛾核多角体病毒VP39蛋白在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒中的功能研究

【目的】构建表达甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica MNPV,AcMNPV),明确SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能,为深入探究杆状病毒的核衣壳装配机理打下理论基础。【方法】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在AcMNPV vp39缺失型重组bacmid(bAcvp39KO)的基础上构建携带SeMNPV vp39基因、绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,egfp)和多角体蛋白基因(Polyhedrin,polh)的重组病毒(vAcSevp39:FLAG)。利用Western blotting检测分析SeMNPV vp39在vAcSevp39:FLAG转染的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9(Sf9)细胞中的表达情况,通过荧光显微镜观察vAcSevp39:FLAG在Sf9中的感染和扩散情况,采用病毒滴度测定并绘制病毒生长曲线检测vAcSevp39:FLAG的感染性芽生型病毒粒子产量,并以电子显微镜观察vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中的形态发生情况。【结果】Western blotting检测结果表明,SeMNPV VP39能在vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中获得表达;荧光显微镜观察和病毒生长曲线测定结果表明,在vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中无感染性的芽生型病毒粒子产生,与AcMNPV vp39缺失型重组病毒(vAcvp39KO)的现象一致;电子显微镜观察发现,与vAcvp39KO不同的是,在vAcSevp39:FLAG转染的细胞中虽然未产生核衣壳,但在感染细胞的核中存在大量空的透明长管状衣壳结构,表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣壳结构装配,但在AcMNPV中不具备装配核衣壳的能力。【结论】SeMNPV VP39在AcMNPV中虽能形成衣壳结构,但不能有效装配核衣壳,导致无芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子产生。

斜纹夜蛾核多角体病毒Splt75基因的生物信息学分析

斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)ORF75(Splt75)是杆状病毒核心基因。通过PCR方法、克隆、测序技术和生物信息学分析工具对Splt75基因及其编码蛋白Splt75进行了研究。结果表明,PCR扩增序列大小为363 bp,与Genbank登录的SpltMNPV G2株基因组全序列(AF325155)中的ORF75基因全长序列同源性100%;Splt75基因编码120个氨基酸,编码蛋白分子量为13137.16 Da,蛋白理论等电点为7.86,是稳定的疏水蛋白,存在跨膜结构区,属于ORF78(Ac78)超家族成员;Splt75蛋白中可能含有1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、1个N-糖基化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个N-豆蔻酰化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点以及1个酰胺化位点;Splt75的二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主要构成元件。Splt75基因及其编码蛋白Splt75的生物信息学分析结果为进一步研究其功能和作用机制提供了理论依据。