CRISPR/Cas9介导的CD34报告基因293AD细胞系的构建

CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。

SMP30对肝癌细胞行为学影响及其与糖代谢关系研究

糖代谢是癌症的一个典型特征,研究显示SMP30(senescence marker protein 30)是一种肝癌相关抗原,与脂代谢关系密切,为了探讨SMP30与糖代谢的变化是否相关,我们构建了稳定转染SMP30的人SK-HEP1肝癌细胞株。通过迁移实验、侵袭实验和CCK8实验对比检测了过表达SMP30组与对照组肝癌细胞的迁移、侵袭、增殖的情况;同时还检测了细胞的葡萄糖吸收、乳酸排出的情况。结果显示,与对照组相比,SMP30对SK-HEP1肝癌细胞株的迁移、侵袭有明显的抑制作用(p<0.01);对细胞的增殖作用不明显(p>0.05)。过表达SMP30对肝癌细胞的葡萄糖吸收和乳酸排出作用不显著(p>0.05)。SMP30对肝癌细胞SK-HEP1的迁移、侵袭有一定的抑制作用,但这种作用与糖代谢关系不明显。

Lnc01089在肝癌细胞中的表达分析

为探讨Lnc01089与肝癌细胞侵袭的关系,本研究分析了Lnc01089在肝癌细胞株和肝癌组织中的表达情况。从肝癌细胞株HepG2、Huh7、SMMC-7721和15例成对的肝癌组织及其癌旁组织中提取总的RNA,经逆转录得到cDNA,通过qRT-PCR实验,分析Lnc01089在肝癌组织和这三种肝癌细胞株中的表达水平。结果发现Huh7、SMMC-7721中Lnc01089的表达量明显低于HepG2;肝癌组织中Lnc01089的平均表达量也明显低于癌旁组织,差异均有统计学意义（p〈0.05）。结果提示Lnc01089表达水平的降低与肝细胞的恶性程度有关。因此Lnc01089可能与肝癌的发生、发展有密切联系,有望为肝癌治疗提供新的靶点。