UPLC-MS/MS法快速测定六神曲中的7种真菌毒素

目的建立快速测定六神曲中7种真菌毒素残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。方法色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),流动相为乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol·L^(-1)甲酸氨溶液,梯度洗脱,流速为0.4 mL·min^(-1),柱温为30℃。采用电喷雾离子源,正离子模式,工作模式为多反应监测模式。结果该方法专属性好,7种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数r在0.9987~0.9995之间,平均回收率为84.7%~108.0%,RSD为2.8%~5.8%(n=6)。实际样测定中,10批样品中共有2批检出黄曲霉毒素B1,含量分别为1.24,2.35μg·kg^(-1),其余毒素均未检出。结论该方法快速、简便、回收率高,适用于六神曲中真菌毒素的质量监测。

蜱携带重要人畜共患病毒研究概况

蜱能够传播多种病毒,已知有6个病毒科的病毒能通过蜱虫吸血传播,分别是黄病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科、弹状病毒科、呼肠孤病毒科和非洲猪瘟病毒科。除非洲猪瘟病毒科外,其余病毒均为核糖核酸(RNA)病毒。黄病毒科和布尼亚病毒科病毒可在人类引起脑炎和出血热,因此其意义尤为重要。森林脑炎病毒、波瓦生病毒和克里米亚—刚果热病毒等蜱传病毒引起的人畜共患疾病,近年来在世界上多个地区重新流行。新型蜱传病毒及相关病例不断被发现,例如我国发现的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)以及国外发现的Heartland和波本(Bourbon)病毒等,引起了医学界的广泛重视。随着人类对自然资源的开发,与自然界蜱的接触机会日益增加,导致蜱传病毒性疾病的发病率上升。为了做好及时应对这种潜在公共健康威胁的准备,本文对蜱及其携带的重要病毒特点进行了综述。

东南沿海部队训练伤发生的影响因素和损伤特征分析

目的了解东南沿海部队训练伤发生现状和损伤特征,找出影响部队训练伤发生的独立危险因素。方法采用整群抽样的调查方法,抽取不同地区的7个中队(连)共433人为调查对象,采用问卷调查的方式回顾性调查研究对象的单位、年龄、BMI、人员类别、军种及既往抽烟、饮酒、睡眠、饮食和入伍前身体状况、训练时间等信息,了解训练伤的发生特征;通过多因素Logistic回归分析揭示训练伤发生的独立影响因素。结果调查共收集有效调查问卷417份,其中发生训练伤158份,过去1年训练伤发生率37. 89%。多因素Logistic回归分析显示单位、睡眠质量低、饮食结构不合理是训练伤发生的独立影响因素(P <0.05)。训练伤发生全年较为均衡,损伤部位主要在腰部和膝关节。引起训练伤的科目和官兵惧怕科目均为5公里武装越野训练、400米障碍训练和器械训练等;客观因素和主观心理因素对训练伤的发生均为重要影响因素。结论东南沿海部队训练伤发生率较高,高发单位、睡眠质量低、饮食结构不合理等人群是训练伤的易感人群,在预防训练伤时,应该加以重点预防与保护。

舟山地区蝙蝠轮状病毒分子鉴定和分析

为监测东南沿海舟山地区蝙蝠携带轮状病毒的流行情况,探索其流行机制,2015—2018年,在浙江省舟山地区采集蝙蝠,以蝙蝠肠组织为模板,设计针对轮状病毒VP3序列的特异引物进行RT-PCR检测。结果显示,2015年采集的65只蝙蝠,轮状病毒阳性率为6.15%(4/65),2016年采集的48只蝙蝠,阳性率为2.08%(1/48),2017年采集的70只蝙蝠,阳性率为2.86%(2/70),而2018年采集的101只蝙蝠,未检测到轮状病毒序列。针对2017年小菲菊头蝠Rhinolophus hipposideros体内发现的一株轮状病毒进行基因组扩增,获取部分基因组序列并进行生物信息学分析,发现VP7基因序列与蝙蝠源轮状病毒相似度最高,同源性为96%;VP3基因序列与人源轮状病毒同源性为90%;VP6基因序列与猫同源性为95%。根据上述结果,我们推测舟山蝙蝠来源轮状病毒是一株重组病毒株,具有潜在跨种传播给人类的可能性。本研究系首次在东南沿海舟山地区蝙蝠体内检测到轮状病毒,对该地区轮状病毒的监测和预警具有一定的公共卫生意义。

利用ARMS-PCR等位基因分型方法对德国小蠊钠通道基因新突变的检测及分型研究

目的了解南京市德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平,建立一种快捷方便的抗性基因检测分型方法,对kdr(knockdown resistance,kdr)基因突变进行检测和分型。方法利用圆球法检测高效氯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯以及右旋反式氯丙炔菊酯对德国小蠊的半数击倒时间(KT),PCR扩增检测kdr基因突变情况。针对1059位氨基酸位点的碱基突变设计引物建立ARMS-PCR检测方法。结果在100 mg/m剂量时,氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯和右旋反式氯丙炔菊酯对德国小蠊试虫的KT值分别20、19、17和8 min。同时在kdr基因的1058-1059氨基酸位点处检测到6种突变基因型,并成功地建立了针对D1059K突变基因型的ARMS-PCR检测方法。结论采集到的德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了不同程度的抗性,且其kdr基因存在着多种新型突变位点。

东南沿海部队官兵中暑现状及影响因素分析

目的了解东南沿海某部部队中暑现状,找出影响东南沿海部队中暑的独立影响因素。方法采用整群抽样的调查方法,于2017年4-10月抽取不同单位、地区的6个中队(连)共356人为调查对象,采用问卷调查分析对象的个体特征、生活习惯、身体状况以及过去一年的中暑情况等相关信息,描述中暑的发病现状和症状特征;通过多因素Logistic回归分析探索中暑的独立危险因素。结果共收集有效调查问卷342份,其中中暑对象53份,中暑发生率15.50%。单因素分析显示单位、年龄、军龄、吸烟、睡眠质量、饮食习惯、入伍前身体状况等组间比较,差异有统计学意义(P<0. 05);纳入多因素logistic回归分析结果显示军龄、睡眠质量差、患有慢性疾病是中暑的独立影响因数(P<0. 05)。结论东南沿海部队中暑发生率较高,军龄较低、睡眠质量差、患有慢性疾病等人群是中暑的易感人群,预防中暑时应该加以重点保护。

2013—2018年江浙皖地区3种重要虫媒病流行时空分布特征

目的分析2013-2018年江浙皖地区3种重要虫媒病(疟疾、登革热和乙型脑炎,含输入性病例)流行的时空分布特征,为进一步做好该地区3种虫媒病防治工作提供参考。方法收集江浙皖地区2013-2018年疟疾、登革热和乙型脑炎发病数据,对该地区3种虫媒病流行情况的时空分布进行统计分析。结果2013-2018年,江浙皖地区疟疾、登革热和乙型脑炎累计病例分别为3811、1815和401例,病例的人群比率分别为0.33/10万、0.16/10万和0.034/10万。从3种疾病年均值而言,疟疾病例从每年3月46个病例开始上升,5月达高峰,达到63个病例,7月开始下降。登革热病例从每年的5月9个病例开始上升,9月达高峰,有160个病例,10月后开始下降。乙脑病例从每年的5月1个病例开始上升,7月达高峰,有36个病例,8月后开始下降。值得注意的是,输入性疟疾、登革热和乙型脑炎在三省中均占有极大比例,尤其,江苏和浙江近几年疟疾、登革热均以输入性病例为主。江浙皖地区2013-2018年疟疾、登革热和乙型脑炎,在该地区自然疫源性及虫媒传染病总数的排名几乎均为前5位。结论江浙皖地区2013-2018年疟疾和乙脑呈逐年下降趋势,登革热呈先下降、后上升、再下降的趋势。因此仍需加强媒介控制与输入性病例的管理,对驻防该地区的部队和在该地区野外作训期间,尤其是疫情高发季节和地区,有必要针对性地加强官兵个人防护。

东南沿海部队皮肤病发生特征及影响因素分析

目的调查东南沿海部队皮肤病发生现状,分析影响部队皮肤病发生的危险因素,为皮肤病防治提供理论依据。方法2017年11月至2018年11月,采用整群抽样的调查方法,从6个训练单位中,每个单位随机抽取一个中队(连),共376人为调查对象,采用问卷调查的方式回顾性调查研究对象的单位类别、身体质量指数(BMI)、人员类别、军种、既往抽烟、饮酒、睡眠、饮食、入伍前身体状况、卫生条件以及卫生习惯等信息,统计过去1年内皮肤病的发病特征;通过多因素Logistic回归分析皮肤病发生的影响因素。结果共收集有效调查问卷367份,其中发生皮肤病217人,皮肤病发生率59.13%。多因素Logistic回归分析显示BMI(P=0.02)、睡眠质量差(P=0.04)、宿舍卫生打扫频率低(P=0.03)、居住环境拥挤(P=0.04)、单位类别(均P<0.05)是皮肤病发生的影响因素。官兵所患皮肤疾病种类主要为感染类皮肤病272例(74.10%)、物理性皮肤病192例(52.31%)、皮炎湿疹类皮肤病132例(35.97%)。结论东南沿海皮肤病发病率较高,BMI较高、睡眠质量差、居住环境拥挤和卫生条件不佳等情况均会增加皮肤病的发病率,应采取针对性的保障措施。

中国东南沿海蝙蝠携带细小病毒的初步分子鉴定

为了研究中国东南沿海地区蝙蝠作为媒介和宿主携带重要人兽共患病毒的种类及分布情况,分析蝙蝠传播病毒的可能性,从东南沿海地区多个采样点采集了一定数量的成年蝙蝠样本,取部分肠道组织样本进行处理后,用高通量测序和生物信息学对其携带病毒的核酸序列进行了提取和分析。结果显示,蝙蝠携带多种昆虫病毒、植物病毒和脊椎动物病毒,其中细小病毒读长占比最多,15 012个病毒读长中有12 894个是细小病毒序列。针对高通量测序结果,对蝙蝠携带的细小病毒进行了鉴定与分析,并获取了大部分编码区基因,同源比对发现与BtRf-PV病毒株和SX2013株同源性最高,为91%。在采集的268只蝙蝠中,检测到16只携带细小病毒,阳性率为5.9%。

0.5%吡丙醚颗粒剂对蚊蝇幼虫的药效研究

目的评价0.5%吡丙醚颗粒剂对蚊蝇幼虫的实验室和现场药效。方法在实验室和现场对蚊蝇幼虫分别按10、30 g/m^(2)颗粒剂量进行试验。结果实验室试验:一个发育周期内蚊蝇幼虫死亡率分别为34.33%、8.67%,蛹的阻止羽化率分别为99.49%、100%。现场药效试验:现场投药后将蚊蝇幼虫带回实验室饲养,蚊蝇幼虫死亡率分别为23%、31%,阻止羽化率分别为81.82%、86.96%;现场试验区蚊幼虫5~20 d内相关密度指数均大于50,相对密度下降率为16.37%~24.39%,而蛹相关密度指数均小于50,相对密度下降率为69.39%~82.14%,20 d后蚊幼虫及蛹密度均逐步回升,30 d蚊幼虫相关密度指数大于100。结论该制剂对蚊蝇幼虫杀灭率较低,但对蛹羽化有较高的抑制率。

舟山群岛地区蝙蝠博卡病毒的初步鉴定与分析

为进一步了解我国蝙蝠携带博卡病毒(Bocavirus)的分布状况和遗传多样性特征,本研究采集舟山群岛地区4种蝙蝠的肠组织样本,使用套式PCR方法进行蝙蝠博卡病毒检测,分析该地区蝙蝠携带博卡病毒的遗传多样性。结果显示,从141只蝙蝠(菲菊头蝠、马铁菊头蝠、大卫鼠耳蝠和渡濑式鼠耳蝠)体内共检测出7份博卡病毒的DNA目的条带,经测序后获得5条博卡病毒序列,系统进化分析表明蝙蝠源博卡病毒同已发现的其他博卡病毒属于不同的进化分支。序列遗传进化分析显示,5条序列的同源性介于98.9%~100%之间,与其他博卡病毒的同源性介于50.8%~77.2%之间;根据ICTV关于博卡病毒属新种的判定标准,该地区检测出蝙蝠源博卡病毒为新的博卡病毒种类。

基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测研究

目的基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性,建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检测技术。方法参照新型冠状病毒的基因序列,利用生信技术筛选并设计合成多个新型冠状病毒特异的crRNA(CRISPR RNA),以体外转录的通用ssRNA(单链RNA)靶标建立检测技术并优化检测体系,以新型冠状病毒假病毒核酸标准物来评价方法检测限。收集临床样本,其中阳性样本应包含不同的新型冠状病毒变异株,阴性样本包括其他的常见呼吸道病原体(甲型流感病毒/乙型流感病毒、人类副流感病毒、肺炎克雷伯菌等)临床样本。分别用实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR及本研究建立的免扩增可视化快速检测技术,对各种样本进行检测,分析评价新建立技术的灵敏度和特异度。采用四格表确切概率法针对荧光定量PCR、数字PCR与本技术检测结果进行统计学分析,采用双侧检验,P<0.01为差异有统计学意义。结果本研究设计合成了10条crRNA,用于基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术的建立与优化,本技术可在最短6 min内检出新型冠状病毒的核酸。利用新型冠状病毒假病毒核酸标准物评价该技术的检测限,结果显示仪器辅助下本技术检测限为14拷贝/μl,肉眼下检测限为28拷贝/μl。以qPCR和数字PCR确认的113份临床样本对所建立的检测技术进行敏感度和特异度分析,利用相关公式及SPSS22软件计算分析,该检测技术的敏感度98.5%(66/67),特异度100%(46/46),本研究建立的基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒免扩增可视化快速检测技术检测结果与金标准qPCR检测结果差异无统计学意义(P=1)。结论本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术,该技术流程简单、操作便捷,对操作环境要求低,检测限接近qPCR,有较强的现场检测应用潜力。

大肠杆菌hfq和rne-710基因的双质粒无痕敲除技术

基因敲除技术是了解基因功能的重要技术手段。以大肠杆菌K-12 MG1655基因组hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)基因为模型,首先构建Δhfq∷Spe和Δrne-710∷Spe菌株,通过融合PCR方法分别构建缺失hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)的融合片段并连接至辅助质粒,缺失hfq和rne-710的片段经重组分别替换壮观霉素抗性盒,得到无痕敲除株Δhfq和Δrne-710。双质粒无痕敲除和融合PCR方法相结合为大片段基因缺失开辟了新的途径。

携带bla_(NDM-1)的质粒pNDM-BJ01在鲁氏不动杆菌中的适应度代价

【目的】了解编码新德里金属-β-内酰胺酶-1(blaNDM-1)的质粒pNDM-BJ01在鲁氏不动杆菌10621菌株中的适应度代价,进而评估该质粒在鲁氏不动杆菌群体中存续和扩散的潜能。【方法】通过不含亚胺培南的液体培养基连续传代培养,获得抗性质粒丢失的10621衍生菌株,利用生长曲线、生物被膜、无营养生存时间等体外适应度测量实验,分析10621NDM-1(+)及质粒缺失的10621NDM-1(-)之间的适应度差异。【结果】pNDM-BJ01在10621菌株中不稳定,连续传代11次即在群体中完全丢失。在26℃和37℃下,10621NDM-1(-)与10621NDM-1(+)菌株的生长曲线无显著性差异。在26℃条件下,10621NDM-1(-)菌株形成生物被膜的能力明显强于10621NDM-1(+),而在37℃条件下,10621NDM-1(+)强于10621NDM-1(-)。在无营养的PBS缓冲液中,10621NDM-1(-)菌株生存能力明显高于10621NDM-1(+)。【结论】编码blaNDM-1的质粒pNDM-BJ01在鲁氏不动杆菌中具有较大的适应度代价,缺失这一质粒的菌株在外界环境中的生存能力强于抗性菌株,pNDM-BJ01在鲁氏不动杆菌存续与扩散的能力有限。

鼠疫耶尔森菌基因组无痕修饰方法的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)中基因组无痕修饰的技术平台,深入研究鼠疫菌相关基因的功能及作用机制。方法通过不对称PCR扩增抗性盒片段(含修饰靶标区域上下游同源臂),将其导入含pKD46质粒的鼠疫菌中。在阿拉伯糖的诱导下,pKD46质粒可表达与同源重组相关的3个酶(Exo,Beta和Gam蛋白),诱导重组后再导入p KSI-1质粒与目的基因的重组载体,与抗性盒进行第二次同源重组。通过加入阿拉伯糖和IPTG诱导pREDTKI表达重组酶和I-SceⅠ酶,可对未发生重组的抗性盒片段和p KSI-1质粒上的I-SceⅠ位点酶切,从而起到消除抗性盒与质粒作用,达到无痕修饰的目的。结果与结论成功构建了鼠疫菌的Δwaa A和waa A(△9nt)两个突变株。根据不同的实验目的选择相应的基因敲除方法,得到的无痕修饰菌株为鼠疫菌相关基因的功能研究奠定了基础。

耐环丙沙星鲍氏不动杆菌中喹诺酮耐药相关基因分析

目的研究鲍氏不动杆菌(ABA)临床分离株对喹诺酮类抗生素耐药机制。方法收集来自6家医院的114株耐环丙沙星ABA临床分离菌株,PCR扩增喹诺酮类抗生素结合靶基因(gyrA、gyrB、parC和parE),并进行序列测定,与参考菌株ATCC17978基因组进行比对,确定其喹诺酮耐药决定区是否存在耐药相关突变;PCR扩增9个质粒介导的喹诺酮类耐药基因[qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr、oqxA和oqxB],并对阳性扩增产物进行测序以确定基因亚型。结果绝大部分菌株(113/114,99.1%)的gyrA基因发生了Ser83Leu突变,其中67株菌(67/114,58.8%)同时发生了parC基因的Ser80Leu突变,以上两种突变是常见的喹诺酮耐药相关突变。与标准菌株进行比对,受试菌株gyrB基因Arg393Ser、Arg393Cys、Thr401Ala、Pro406Ser、Val430Phe、Cys440Ser和Gly480Arg突变率分别为95.6%、0.9%、96.5%、96.5%、100%、96.5%和96.5%;parE基因在7个位点发生了同义突变,突变率>96%。83.3%(95/114)的菌株中检出aac(6')-Ⅰb基因,但不存在"cr"突变,其余质粒介导的喹诺酮类耐药基因扩增均为阴性。结论该研究耐环丙沙星ABA中未发现质粒介导的喹诺酮耐药基因,在gyrB和parE基因中发现的突变可能与环丙沙星耐药性无关,实验菌株的环丙沙星耐药性主要与染色体上的喹诺酮耐药决定区GyrASer83Leu和ParC-Ser80Leu两种突变相关。