苹果锈果类病毒RT-PCR检测体系的建立

为了开发苹果锈果类病毒（ASSVd）快速、准确的RT—PCR检测方法，以感染苹果锈果类病毒的田间苹果枝条为试材，对苹果锈果类病毒RT—PCR反应体系和程序进行选择和优化，利用优化的检测体系对保定市曲阳县苹果园苗木及3—5年生母本树苹果锈果病的发生情况进行检测，验证该体系的可靠性。结果表明：自行设计引物ASSVdQCxin3特异性最好，优化体系灵敏度达到能够检测3．75ng新鲜样本中的病毒，可准确、灵敏检测苹果锈果类病毒田间样本；曲阳县苹果园48株苗木中携带苹果锈果类病毒13株，带毒率为27．1％；18株母本树中携带苹果锈果类病毒5株，带毒率为27.8％。

利用内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术

为开发准确、灵敏的苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)RT-PCR检测方法,以田间染病苹果组织为试材,提取高质量总RNA为模板,在常规RT-PCR检测体系中引入苹果线粒体nad5基因作为内标基因,对RT-PCR反应体系和程序进行优化,并测定其灵敏度和稳定性,最后利用优化的检测体系确定苹果果实着色期最佳检测部位。结果表明:以RNA提取改良法提取总RNA为模板合成cDNA后,进行PCR扩增,优化后的PCR体系(25μL)中cDNA模板2μL、ASSVd(20pmol/μL)正反向引物各1.0μL,nad5(20pmol/μL)正反向引物各0.1μL;扩增程序中退火温度为60.9℃,循环次数为35次;检测灵敏度为37.5ng新鲜样本;果实着色期,染病植株的幼嫩叶片、1a生枝的韧皮部和木质部、果实及部分种子样本均能检测到病毒,最佳检测部位为幼嫩韧皮部。研究结果可以为ASSVd高效、快速、准确的检测提供可靠方法,并为田间病害诊断及无毒苗木繁育提供依据和借鉴。