甘薯离体诱变与抗盐突变体鉴定

为了获得甘薯抗盐突变体材料,本研究以平阳霉素(PYM)为诱变剂处理徐薯18的茎段获得甘薯突变体植株,并在NaCI培养基中筛选抗盐突变株系。结果表明,1.00 mg·L^(-1)PYM为徐薯18茎段诱变处理14 d后的半致死浓度。将徐薯18茎段接种至含不同浓度NaCl的MS培养基,结果表明125 mmol·L^(-1)NaCl为抗盐突变体的筛选浓度。最后,将经1.00 mg·L^(-1)PYM处理14 d后的甘薯植株的茎段接种到含125 mmol·L^(-1)NaCl的MS培养基,通过生根率筛选抗盐植株。盐胁迫下生根率最高的3株诱变植株的根长、株高、根鲜重、地上部鲜重、总鲜重、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量等指标的测定结果表明,这3株诱变植株的各形态和生理指标均显著优于诱变亲本徐薯18。隶属函数分析结果表明,这3株诱变植株的抗盐性均显著高于诱变亲本。与诱变亲本徐薯18相比,盐胁迫下3株突变体中的抗盐相关基因IbSOD、IbPOD、IbAPX和IbSOS的表达量均显著高于诱变亲本。本研究筛选到的抗盐甘薯突变体材料对甘薯抗盐新品种的培育及抗盐性遗传机理的研究具有重要意义。

马铃薯PDS和ZDS基因的克隆与表达特性分析

八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase)是类胡萝卜素合成通路上的关键限速酶,影响植物体内类胡萝卜素的合成。为解析PDS和ZDS在马铃薯类胡萝卜素合成途径中的作用,为马铃薯类胡萝卜素合成的分子调控机理解析和新品种创制奠定基础,研究从黄心马铃薯晋薯16号品种中克隆PDS和ZDS基因,利用生物信息学工具对这2个基因及其所编码的蛋白序列进行分析,并对二者在不同组织内的表达模式进行定量检测。结果表明,克隆得到PDS和ZDS基因长度分别为1 752、1 767 bp,分别编码583、588个氨基酸;StPDS的分子质量为64.97 ku,理论等电点为6.41;StZDS的分子质量为64.73 ku,理论等电点8.51;PDS和ZDS均属于亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析表明,马铃薯晋薯16号的PDS和ZDS分别与番茄PDS和ZDS的同源性最高。通过测定3个不同马铃薯品种晋薯16号、红玫瑰2号和希森8号叶片和薯块中的类胡萝卜素含量,发现在同一组织中,红玫瑰2号的类胡萝卜素含量显著高于希森8号和晋薯16号,这一结果说明,StPDS和StZDS基因可能正向调控马铃薯块茎类胡萝卜素的积累;在同一品种中,类胡萝卜素含量较少的叶片中StPDS和StZDS基因表达量却远远高于块茎中基因的表达量,推测这2个基因可能参与叶片的光合作用。

甘薯Iborf56基因的克隆与表达分析

为了研究甘薯叶绿体基因Iborf56的表达是否受到盐胁迫的诱导以及对生长发育的影响,为甘薯的品种选育提供参考,以栗子香为研究材料,从中克隆Iborf56基因,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征,亚细胞定位预测、系统发育分析、调控元件分析、不同组织及盐胁迫表达模式,以及qPCR验证该基因的表达量。结果表明,Iborf56与已知序列相似度为99.28%,开放阅读框长度为929 bp,编码60个氨基酸,含有8个磷酸化位点,没有信号肽和跨膜区,不具有分泌蛋白的特性,主要由α-螺旋组成;亚细胞定位在叶绿体基质中;进化树分析表明,Iborf56与三浅裂野牵牛(Ipomoea trifida)和三裂叶薯(Ipomoea triloba)的遗传距离最近;启动子元件分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、抗逆和激素应答等功能元件。转录组以及实时荧光qRT-PCR定量分析表明,Iborf56在甘薯叶片中的表达量最高且随生长时间增加呈显著上升趋势,推测该基因参与甘薯的生长发育;此外,Iborf56基因的表达量随盐胁迫时间表现为先升后降的趋势,且该基因在盐胁迫下12 h时达到了临界值,暗示其可能参与甘薯盐胁迫响应。

甘薯IbWRKY44的克隆与表达分析

WRKY家族是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物的生长发育、次生物质代谢以及逆境响应等生物学过程。甘薯中存在许多WRKY基因家族成员,但这些基因是否参与花青素的生物合成尚未报道。研究克隆了在紫心甘薯和白心甘薯块根中差异表达的IbWRKY44基因,其ORF全长为1401 bp,编码446个氨基酸。系统进化分析表明,IbWRKY44蛋白与同属旋花科三叶裂薯ItWRKY44和牵牛InWRKY44的亲缘关系最近,与葡萄VvWRKY44的亲缘关系最远。IbWRKY44的启动子中包括激素响应、光响应和厌氧诱导响应等多种元件以及AP1、MYB和MYC等转录因子的结合位点。利用qRT-PCR分析了IbWRKY44在不同甘薯品种中的表达特性,发现IbWRKY44在紫心甘薯块根中的表达量显著高于非紫心甘薯,推测IbWRKY44参与花青素的生物合成。构建了过表达带有绿色荧光的融合表达载体pCAMBIA1300-IbWRKY44-GFP并进行烟草叶片的亚细胞定位分析,结果显示,IbWRKY44基因编码的蛋白定位于细胞核。

甘薯IbKFB互作蛋白的筛选及分析

甘薯(Ipomoea batatas)是一种极为重要的粮食、饲料和工业原料类块根作物。与普通甘薯相比,紫心甘薯块根中富含花青素,已成为当前功能性食品开发的热点作物。本课题组前期通过不同薯肉颜色的甘薯块根的小RNA、降解组和转录组测序以及靶向代谢组联合分析发现,Ib-miRNA2111及其候选靶基因(IbKFB)可能参与花青素生物合成调控。为了深入探究IbKFB在甘薯花青素生物合成过程中的功能和调控机理,本研究克隆了IbKFB基因,构建IbKFB的酵母双杂诱饵载体pGBKT7-IbKFB,采用酵母双杂交(Y2H)技术从甘薯cDNA文库中筛选出21个与IbKFB相互作用的候选蛋白。通过对这些蛋白进行功能注释和分析,鉴定出5个注释与花青素生物合成相关的候选蛋白,分别为IbPAL、IbSAUR50、IbERF、IbWDR11和IbGAPCp1。进一步利用Y2H回转实验和双分子荧光互补实验(BiFC)验证了IbKFB与候选蛋白相互作用的真实性。本研究可丰富甘薯花青素生物合成的分子调控网络和植物地下器官花青素代谢调控机制的认识,为花青素生物强化专用型甘薯新种质的创制提供分子理论基础和基因资源。