基于全基因组重测序信息开发玉米H99自交系特异分子标记

随着基因组测序技术和计算生物学的发展,利用生物信息学的方法大规模挖掘基因组特异分子标记已成为可能。玉米自交系H99具有较强的可再生能力,是玉米转基因研究的主要供体材料,但是目前对H99基因组信息了解甚少。本研究利用高通量Illumina测序技术,对H99全基因组进行重测序,利用生物信息学手段大规模挖掘并开发了4043个H99特异性的SSR分子标记。随后利用模拟PCR策略,对开发的SSR分子标记进行电子多态性筛选,针对B73×H99、Mo17×H99和B73×Mo17三个群体亲本组合共开发2699候选的特异多态性SSR分子标记。随机挑选20对SSR分子标记对群体亲本B73、H99和Mo17进行多态性筛选,进一步证实候选的多态性具有95%的准确率。此外,基于B73参考序列对开发的多态性SSR分子标记进行全基因组染色体定位及基因注释,揭示了候选多态性SSR分子标记在全基因组及基因内的分布特征。为玉米自交系H99开发了大量的分子标记资源,同时也为快速开发品种间多态性分子标记提供了一套高效可行的分析方法。

利用玉米高通量RNA-Seq数据预测长链非编码RNA(LncRNA)

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是指不具备编码蛋白质能力的RNA。其中,一类长度大于200 nt的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)因其在多层面对基因表达存在调控作用而逐渐成为研究热点。但是由于缺乏有效、准确的预测手段,植物中LncRNA研究相对滞后。本研究结合植物基因组特点以及高通量RNA测序数据,通过生物信息学手段发展、优化了一套基于RNA-Seq数据的植物LncRNA筛选及鉴定方法。随后,利用玉米B73顶端分生组织RNA-Seq数据,预测了6 122条玉米LncRNA,并对其进行了全基因组物理定位。该方法为LncRNA鉴定和后续的功能分析提供了重要的基础。

数字版权管理系统中的角色访问控制模型

在对数字版权管理系统分析的基础上,针对数字版权管理系统的结构特点,提出了一种数字版权管理系统的角色访问控制模型。应用该模型能够减少管理开销,并能提高系统的可扩展性。该模型预测速度快,准确度较高,有很好的适应性和良好的竞争优势。

玉米Dof转录因子家族的全基因组鉴定与分析

【目的】全基因组水平鉴定并解析玉米Dof(DNA binding with one finger)基因家族。【方法】基于玉米V3基因组数据鉴定玉米Dof基因家族,并从基因的结构、系统发育关系、染色体的位置分布、玉米不同组织和不同生理发育阶段基因的表达谱以及在充足氮(sufficient nitrogen,SN)和低氮(limiting nitrogen,LN)条件下V3期叶组织基因的差异表达5个方面分析玉米Dof基因家族。【结果】玉米参考基因组中存在46个Dof结构域基因,命名为Zm V3Dof1—Zm V3Dof46。通过系统发育关系和序列相似性将该基因家族分为8个亚类(Subgroup)S1—S8,每个亚类有3—8个Dof基因。通过分析该家族染色体分布,发现玉米10条染色体,除Chr.9外,均有Dof基因的分布,其中,在Chr.1上分布最为密集,有12个Zm V3Dofs;在Chr.5和Chr.3上分布次之,分别为8和7个Zm V3Dofs;在其他染色体上则分布较少,此外,Dofs在Chr.1的底部、Chr.5的顶部和底部分布密度相对较高。表达谱分析结果表明,Dof基因家族成员在不同组织及不同发育阶段均有差异表达,预示不同Dof基因功能的多样性以及在植物发育过程中扮演着不同角色,且同一亚类Dof基因表达模式存在一定程度的相似性。此外,玉米Dof基因家族对氮响应较为敏感,充足氮(SN)和低氮(LN)条件下,V3期叶组织基因的RNAseq表达结果显示35个Dof基因在2种氮处理下表达量存在差异,其中13个基因表达量差异较大。值得注意的是21个Dof基因在低氮处理下表达量上调,其中8个基因只在低氮条件下表达。【结论】基于最新版基因组数据鉴定玉米在自交系B73基因组中存在46个Dof基因,Dof基因家族成员参与玉米不同生理发育过程中,部分基因可能在氮代谢调控中发挥积极作用。

玉米YABBY基因家族的全基因组鉴定与分析

YABBY基因家族作为植物特有的转录因子家族,在调控植物侧生器官发育中发挥重要作用。本研究利用玉米全基因组数据分析玉米YABBY基因家族,阐明该基因家族成员结构、系统进化发育关系以及基因家族成员在玉米不同组织及不同发育时期的表达谱。结果显示,玉米参考基因组中存在13个YABBY基因,命名为Zm YABBY1~Zm YABBY13,根据系统发育关系和序列相似性将该基因家族分为4亚类S1~S4。RNAseq数据显示玉米YABBY基因在籽粒、茎和茎端分生组织（Shoot apical meristem,SAM）、幼胚及叶片中有较高表达,预示玉米YABBY基因可能在上述器官发育中发挥调控作用。本研究结果为进一步解析该基因家族的功能奠定了研究基础。

玉米氮素敏感性差异自交系的表达谱分析

玉米基因型的氮肥敏感性存在显著差异,但基因表达模式尚不清楚。本研究以玉米氮敏感型自交系B73和钝感型自交系Mo17为材料,对足氮(sufficient nitrogen,SN)和低氮(limiting nitrogen,LN)条件下苗期叶片组织的转录组进行了分析。对于叶片总氮含量,敏感型B73在足氮和低氮条件下存在显著差异,而钝感型Mo17的差异小且不显著。基因表达差异分析显示,Mo17在2种氮环境下差异基因达13 867个,在低氮环境下上调基因是数下调基因数的1.9倍(9044/4823);B73差异基因数为10 028个,低氮环境下上调基因少于下调基因数(4233/5795)。基因聚类分析也显示,低氮环境下钝感型Mo17基因表达上调或下调的幅度高于敏感型B73。差异基因双尾方差分析表明,受氮环境和基因型共同影响的差异基因为342个,功能主要集中在与氨基酸代谢、光合作用、次级代谢及基因复制表达等途径。综上所述,在低氮条件下氮钝感型Mo17较敏感型B73激活更多的基因来提高植株对氮的吸收和同化能力,被激活的基因可能与玉米氮肥同化和利用有关。

玉米籽粒主要性状与蛋白质含量的相关性

为了探明玉米籽粒主要性状之间的相关性,以蛋白含量不同的2个亲本进行杂交的F2群体367个单株的籽粒蛋白质含量与百粒质量、籽粒面积、淀粉含量、含油量的相关性进行了系统研究,旨在为玉米高蛋白育种杂交后代选择提供理论依据。结果表明,蛋白含量与百粒质量、籽粒面积、含油量之间均为负相关,但相关程度不显著;与淀粉含量呈现显著负相关。因此可用低淀粉含量作为高蛋白育种中的间接选择性状。

玉米InDel标记20重PCR检测体系的建立

为构建玉米多重PCR检测体系,提高分子标记检测效率,利用10份代表性玉米材料对238对InDel引物进行单重PCR评估,共得到192对扩增效率高、稳定性好的引物。根据软件评估结果、扩增质量、产物范围、染色体均匀分布原则从192对引物中优选出30对综合表现较好的引物形成扩增产物范围在80~200 bp和200~400 bp的两组核心引物组合,每套组合中有10对引物分布在不同染色体上。在核心引物组合的基础上综合考虑染色体分布、碱基片段范围、引物荧光颜色,逐一添加引物,最终形成两组玉米20重PCR体系,一组40重荧光标记毛细管电泳。

基于三重测交群体解析玉米株高与穗位高杂种优势QTL

为检测玉米株高、穗位高杂种优势QTL,以121株intermated B73×Mo17(IBM)个体为基础群体,按照三重测交交配设计构建了三重测交群体,通过完备区间作图法对株高、穗位高杂种优势的主效QTL及互作位点进行了分析。在第9染色体上的2个紧密连锁的区段分别定位到了一个株高、穗位高杂种优势加性QTL位点,单个QTL的表型贡献率为14.3%和18.6%。该QTL可能同时对株高、穗位高杂种优势起作用。在第1、第3染色体上检测到2个株高杂种优势超显性QTL,可解释表型变异的9.0%~11.4%;在第1、第6、第8染色体上检测到5个穗位高杂种优势超显性QTL,可解释表型变异的6.6%~16.8%。进一步分析发现,2对加加上位性互作区段及2对显显上位性互作区段对穗位高杂种优势存在上位性贡献,加加互作效应及显显互作效应可共同解释表型变异的40.7%和26.8%。由此可知,加性、显性及两位点互作上位性共同对株高、穗位高杂种优势存在贡献。本研究检测到的主效QTL位点有助于株高、穗位高在杂种优势育种中的进一步应用。

玉米二态性InDel位点的鉴定和分子标记开发

随着下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的发展,可以利用高通量测序数据挖掘基因组特异的插入/缺失(In Del)位点,这使In Del分子标记的开发成为可能。本研究利用327份玉米自交系的测序数据,通过全基因组结构变异评估发现分布于10条染色体上的25 847个In Del位点。利用PIC值≥0.30的3 304个位点进行系统发育树构建和群体结构分析,其结果与利用SNP位点分析获得的结果高度一致,说明这些多态性较高的In Del位点可以作为代表性标记用于玉米遗传组成的差异分析。采用53对PCR引物进行扩增试验,发现这些In Del引物具有位点专化特征并且其杂交种鉴定的平均杂合率为0.569 2,表明这些标记能准确鉴定出玉米杂交种的杂合度。

半糯粳稻品种核心标记的筛选及DNA指纹图谱的构建

【目的】构建一套基于水稻重要性状基因标记的品种DNA指纹鉴定体系,为加强主栽优良食味半糯粳稻品种的种质管理与品种保护奠定基础。【方法】以34个江浙沪主栽优良食味半糯粳稻品种为供试材料,通过已知标记多态性鉴定、公共数据库基因序列比对、基因组重测序等多种方法对水稻重要性状调控基因的关键差异位点进行筛选,开发核心SNP或InDel标记;利用As-PCR技术将SNP标记发展为依据电泳条带鉴别的简单PCR标记,通过电泳条带特征化和类型分析获得基因型信息,构建半糯粳稻品种的DNA指纹图谱库。【结果】筛选出来源于40个水稻重要性状调控基因的54个核心标记,包括18个SNP标记和36个InDel标记;54个标记在20个品种中共检测到155个有效特征化条带,转化为155个0/1数据位点,建立各品种的DNA指纹数据库,可区分全部供试品种。遗传多样性分析表明,品种间遗传相似性变异范围为0.47—0.90,其中,南粳7718与苏香粳100的相似性系数最小,而南粳9308与南粳9036的相似性系数最大,二者存在8个数据位点差异。亲缘关系分析可将供试品种划分为6个分支,其中,南粳7718为独立分支,表明其与其他品种间的亲缘关系较远。核心标记鉴定效果的进一步验证表明,该套标记可以对14个半糯粳稻新品种进行有效区分,聚类图显示其分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ3个类群,证实各品种间基因型信息的差异性;并利用该套标记鉴定了一个未知半糯水稻的品种真实性,根据基因型和聚类分析,将其判定为南粳9108。【结论】经优化筛选,获得可准确区分当前主推半糯粳稻品种的54个核心标记,并发展为可电泳检测的简单PCR标记,利用该套标记组合构建了34个江浙沪地区主栽优良食味半糯粳稻品种的DNA指纹图谱。

利用三重测交群体解析玉米穗部性状杂种优势遗传学基础

玉米穗部性状与产量密切相关,剖析控制穗部性状杂种优势数量性状位点(QTL)有助于加深杂种优势作用机制的理解,为杂种优势的应用提供理论指导。本研究根据三重测交交配设计方法组配了121个测交后代的三重测交(TTC)群体,并利用完备区间作图法(ICIM)对穗部性状杂种优势进行了QTL分析。经检测,共发现13个主效QTLs。其中,穗长检测到2个QTL,穗粗检测到4个QTL,穗行数检测到1个QTL,行粒数检测到2个QTL,百粒质量检测到4个QTL。这些QTL分别分布于第1、第2、第3、第4、第5和第10染色体上。QTL位点作用模式分析结果表明,超显性位点最多(10个),加性位点最少(2个),单位点可解释8.2%~23.3%的表型变异。对QTL位点上位性互作进一步剖分发现,穗粗、穗行数和百粒质量性状中存在9对不同位点的上位性互作,单位点可解释20.4%~35.3%的表型变异。研究结果表明,加性、显性及两位点上位性互作是玉米穗部性状杂种优势形成的主要遗传学基础。

Opaque2转录因子对玉米α-醇溶蛋白基因家族成员表达的影响

醇溶蛋白是玉米主要的储存蛋白,其中α-醇溶蛋白含量最为丰富,对玉米籽粒品质有重要影响。本研究利用全基因组数据鉴定α-醇溶蛋白基因家族,并从基因保守motif、玉米籽粒不同发育时期基因的表达谱以及转录因子Opaque2对该家族成员表达的影响3个方面分析玉米α-醇溶蛋白基因家族。结果显示,玉米参考基因组中存在39个α-醇溶蛋白基因,其中z1A、z1B、z1C和z1D 4个亚族成员分别为12个、8个、14个和5个。基因保守motif分析发现该家族基因序列高度保守。表达谱分析结果显示该家族表达模式差异较大,其中z1A亚族在籽粒发育时期表达量最高。利用RNA-seq数据剖析在种子发育阶段Opaque 2(O2)野生型和突变体编码该家族成员的表达差异,结果显示O2突变体中z1C亚族成员表达显著下调,z1A亚族表达略有下调,z1B和z1D亚族成员表达量没有显著的变化。本研究在重新注释α-醇溶蛋白家族成员信息的基础上,对该家族的表达谱进行了分析,为今后玉米籽粒品质育种提供了必要遗传信息。

藜麦GRF转录因子家族的鉴定及表达分析

生长调控因子(growth-regulating factor,GRF)是植物特有的一类转录因子,对植物的生长发育起重要的调控作用。藜麦是一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物,也是未来最具潜力的农作物之一。但是关于藜麦GRF基因家族的研究至今尚缺乏报道。因此,本研究利用生物信息学方法,对藜麦GRF基因进行全基因组鉴定,并对其理化性质、基因结构、保守结构域、系统发育关系及组织表达进行分析。结果表明,藜麦中共有18个GRF转录因子,蛋白长度77~621 aa,分子量8.81~67.38 kD,等电点5.23~9.37;每个成员含有1~4个内含子及2~5个外显子,这些GRF蛋白都具有由31~35个氨基酸组成的QLQ保守结构域或由25~43个氨基酸组成的WRC保守结构域。系统进化分析表明,藜麦与拟南芥的GRF转录因子亲缘关系比水稻更近。表达图谱显示,藜麦GRF基因具有明显的组织表达特异性,总体在种子中的表达量较高,其次是在花序和根中,在其他组织中的表达量相对较低。

印度南瓜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因CmaSOS1的克隆与表达分析

Na^+/H^+逆向转运蛋白(SOS1)是植物耐盐的关键因子之一,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为解析印度南瓜SOS1基因的序列特征和功能,利用生物信息学和分子生物学方法对其进行研究。结果表明,克隆获得印度南瓜SOS1基因cDNA全长序列,命名为CmaSOS1,GenBank登录号:NW019272028。序列分析表明,CmaSOS1基因的cDNA全长3940 bp,包含一个3429 bp的开放阅读框架,编码1142个氨基酸。CmaSOS1基因含有23个外显子和22个内含子,全长46314 bp。CmaSOS1蛋白的分子量为126.7 kDa,理论等电点为5.92,包含12个跨膜结构区域,具有一个NaHExchanger superfamily结构域和一个CAPED superfamily结构域;CmaSOS1蛋白属于疏水性稳定蛋白,二级结构元件多为无规卷曲和α-螺旋。CmaSOS1蛋白与葫芦科的中国南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜和苦瓜Na^+/H^+逆向转运蛋白的同源性较高,序列一致性分别为98%、98%、90%、89%和89%。实时荧光定量PCR分析表明,CmaSOS1基因在印度南瓜的根和叶中表达量较高,在茎、花、果实中的表达量较低;该基因受NaCl和聚乙二醇(PEG)诱导后均呈上调表达,推测CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御盐分胁迫和干旱胁迫过程中发挥重要作用。本研究为进一步揭示CmSOS1在非生物胁迫下的功能奠定了基础。

藜麦CqCIPK7基因的克隆与表达分析

土壤盐碱化不利于作物生长,从而影响作物产量,严重限制农业的可持续发展[1-4]。过量的盐分会引起离子和渗透胁迫,严重危害植物的光合作用、生长发育、能量代谢和蛋白质合成[5-7]。植物主要通过感知和转导胁迫信号来响应盐胁迫。在长期的进化过程中,植物形成了多种复杂的机制来保护自己免受盐胁迫的危害,包括限制Na+吸收、增加Na+外排以及液泡内Na+的区隔化,还可以控制Na+从根部向植株地上部的运输[8-9]。研究者还发现,维持细胞质中K+/Na+的稳定比值对植物细胞功能的发挥非常重要[10]。

基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的棉花EcoTILLING技术体系创建

以棉花纤维发育相关基因GhSUS1为目标基因,从EcoTILLING技术中常用的关键酶CELⅠ的提取、活性检测、目标基因引物设计及酶切等方面入手,开展了棉花EcoTILLING技术体系的创建研究。结果表明:所提取的CELⅠ活性高,稳定性好。在42℃、酶切体系为8μL PCR扩增产物中加入2μL粗酶液,与缓冲液等量混合,酶切45 min,能有效地对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)所在的异源双链错配位点进行酶切。对棉花GhSUS1基因设计A和D染色体亚组特异性引物进行等位基因的多态性分析,结果表明:EcoTILLING结果与测序结果一致,说明建立的基于PAGE的Eco-TILLING技术体系稳定可靠,可用于棉花复等位基因发掘研究。

玉米籽粒蛋白含量Meta-QTL及候选基因分析

玉米的蛋白含量与品质直接相关,可通过各种遗传群体对籽粒蛋白进行QTL分析。但是由于使用不同的遗传图谱和分子标记,结果之间无法直接比较分析,数据也无法整合和利用。为了综合、系统分析玉米籽粒蛋白的QTL位点,收集和整理了289个已报道的玉米籽粒蛋白含量QTL相关信息,采用Bio Mercator4.2软件整合不同遗传图谱,通过元分析发掘到44个meta-QTL(MQTL),研究确定了13个在不同遗传群体间具有一致性的QTL位点。利用生物信息学注释一致性QTL位点区段相关候选基因的功能,获得了847个候选基因,功能富集化分析发现13个候选基因显著富集在9个生物学过程中。这些meta-QTL位点及相关候选基因分析可以为玉米籽粒蛋白的分子标记辅助育种、精细定位和基因克隆提供有用的信息。

盐胁迫对不同藜麦品种幼苗生长及CqNHX1基因表达的影响

为了筛选出耐盐性较强的藜麦品种并为苗期耐盐性鉴定提供参考,以3个不同的藜麦品种为试验材料,在盐胁迫下用测量法测定其相关生长指标,紫外分光光度计法测定叶绿素含量,电导法测定相对离子渗透率,并利用实时荧光定量PCR法比较了耐盐基因CqNHX1的相对表达量。结果表明,NaCl胁迫下SQ1株高降幅较小,生物量有所增加,相对离子渗透率几乎不变,且CqNHX1a和CqNHX1b表达量均极显著升高,说明SQ1在高盐环境下能正常生长;SQ34的株高和叶绿素含量均显著降低,生物量保持不变,而CqNHX1a和CqNHX1b表达量均显著升高;QQ61的根冠比和叶绿素含量极显著下降,相对离子渗透率极显著升高,CqNHX1a和CqNHX1b呈下调表达,说明该品种耐盐性较弱。藜麦品种间耐盐性存在显著差异,耐盐性强弱为:SQ1> SQ34> QQ61,SQ1作为高耐盐品种,可在盐碱地进一步推广种植。

InDel分子标记WC656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5VS纯合易位中的应用

簇毛麦是小麦品种改良重要的遗传资源,其5VS上含有硬度基因Dina/Dinb、抗白粉病基因Pm55和抗条锈病基因Yr5V,创制普通小麦-簇毛麦5VS易位系新种质,对于高效利用5VS上的有益基因进行小麦品种遗传改良具有重要意义。为了便于鉴别普通小麦-簇毛麦5VS纯合易位,本研究以mInDel软件分析普通小麦中国春基因组序列,开发了小麦第5同源群短臂的InDel特异分子标记WC656,对小麦品种以及普通小麦-簇毛麦5VS.5AL和5VS.5DL易位系及其衍生后代进行PCR扩增,根据扩增片段大小来区分5AS、5BS、5DS染色体臂以及5VS易位系。结果表明,在21个普通小麦品种、小麦-簇毛麦5VS回交F 2代中杂合易位单株,均扩增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)、422 bp(5DS)3条带。在T5VS.5AL高代品系、回交F 2代中纯合易位单株扩增出471 bp(5BS)、422 bp(5DS)2条带,379 bp(5AS)条带缺失。T5VS.5DL高代品系、回交F 2代中纯合易位单株扩增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)2条带,422 bp(5DS)条带缺失。WC656鉴别的5VS纯合易位结果与顺序FISH-GISH分析结果一致。T5VS.5AL、T5VS.5DL具有抗白粉病、籽粒硬度指数低等优良特性。因此,利用InDel分子标记WC656可以鉴别普通小麦-簇毛麦T5VS.5AL、T5VS.5DL衍生后代中的纯合易位,PCR扩增实验操作相对简便,可以为分子标记辅助选育携有5VS纯合易位的软质弱筋小麦提供帮助。