丙二醇联合肝细胞生长因子修饰牙髓干细胞外泌体保护人表皮细胞的放射损伤

背景:肿瘤放疗以及核事故等原因引起的放射性皮肤损伤救治仍旧是一个严重的医学问题,单一的防治手段均难以达到有效的治疗结果,寻找新的综合治疗手段是重要的研究方向。目的:观察丙二醇联合肝细胞生长因子修饰牙髓干细胞来源外泌体对于人表皮放射性损伤细胞模型的保护作用及相关作用机制。方法:①使用携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒感染人牙髓干细胞,超速离心法分离制备外泌体,即Ad.HGF DPSC-Exo。②通过X射线照射诱导人表皮细胞HaCaT放射损伤,细胞分别于照射前用丙二醇预处理,照射后用Ad.HGF DPSC-Exo处理。通过CCK-8法测定细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,PCR检测P21和P53的表达水平。结果与结论:丙二醇、Ad.HGF.DPSC-Exo、Ad.HGF.DPSC-Exo+丙二醇均可显著改善HaCaT细胞的生长抑制、减少细胞凋亡、提高细胞增殖和迁移能力,显示出较好的辐射防护效果,且Ad.HGF.DPSC-Exo+丙二醇联合作用效果更好。此外,Ad.HGF.DPSC-Exo+丙二醇能够减轻细胞G2/M期阻滞,降低细胞周期调控基因P53和P21的表达。综上所述,丙二醇预处理联合Ad.HGF.DPSC-Exo能够有效保护放射诱导的HaCaT细胞损伤,为辐射性皮肤损伤的防治提供了新的思路和有效方法。

地黄及其活性成分药理作用研究进展

地黄水提液能够保护胃黏膜,抑制肺纤维化,还具有促进造血、降糖、抗炎、抗肿瘤和促进血管内皮细胞增殖等作用;地黄中的主要化学成分低聚糖可以促进骨骼肌成肌细胞的增殖,对骨髓和脂肪间充质干细胞有保护和诱导分化作用,具有降糖和增强学习记忆能力的作用;梓醇具有降糖、改善学习记忆能力的作用;多糖能改善造血功能,对脂肪间充质干细胞有保护作用,对骨髓间充质干细胞有诱导分化作用,还有中枢抑制作用。本文总结归纳了地黄水提液、低聚糖、多糖以及梓醇的药理作用研究进展。

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)诱导肿瘤细胞凋亡机制的初步研究

邻苯二甲酸二丁酯 (DBP)在体外对肺巨细胞癌细胞 (PG)和人早幼粒白血病细胞 (HL-60 )的增殖有明显的抑制作用 ;经 DBP处理过的 PG细胞 ,DNA断裂 ,在琼脂糖凝胶电泳上呈现出特异的断裂带 ;流式细胞术分析表明 ,DBP能提高 PG细胞的凋亡率 ,并且随作用时间的延长而增大 ;斑点杂交的结果显示 ,被 DBP处理过的 HL-60细胞中某些原癌基因、抑癌基因和肿瘤抑制基因的 m RNA表达水平都有所下降 ,这提示 DBP对

柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量

目的 建立广金钱草中总黄酮的含量测定方法。方法 选用测定波长 2 72 nm,以 6 - C-葡萄糖 - 8- C-木糖洋芹素 (vicenin- 2 )为对照品 ,采用柱色谱 -紫外分光光度法对不同来源的广金钱草进行了总黄酮的含量测定。结果 vicenin- 2在 10 .8～ 2 5 .2 μg/ m L 具有良好的线性关系 ,回归方程为 Y=0 .0 30 9X+0 .0 16 (r=0 .9999) ,平均回收率为 10 0 .82 % ,RSD为 1.30 %。结论 该方法操作简便 ,结果准确 ,重复性好 。

地黄梓醇降糖作用的实验研究

目的研究地黄梓醇对四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影响。方法雄性KM小鼠尾静脉注射四氧嘧啶60 mg/kg建立糖尿病动物模型。梓醇以200,100,50 mg/kg剂量灌胃给药2周,观察其对糖尿病小鼠血糖、血脂和糖耐量的影响。结果梓醇能明显降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠的血糖水平、改善糖耐量和血脂水平,并且呈剂量依赖关系。结论地黄梓醇对四氧嘧啶致糖尿病小鼠有显著的降血糖作用。

CIK细胞体内外抗肝癌细胞作用

目的 :研究肝癌患者CIK(cytokine inducedkiller)细胞的体外杀伤自体肝癌原代细胞的细胞毒活性以及正常人CIK细胞在裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法 :分别分离获得肝癌患者和正常人的外周血单个核细胞 (PBMC) ,加入细胞因子 ,体外诱导成CIK细胞 ,用流式细胞仪对细胞作动态表型分析 ,并与正常人的CIK细胞作对比。用51Cr释放法 ,测定肝癌患者的CIK细胞体外杀伤自体肿瘤细胞的细胞毒活性。在Balb/c裸鼠皮下接种肝癌细胞BEL 740 2 ,观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用 ,并与LAK、PBMC细胞相对比。结果 :肝癌患者的CIK细胞体外增殖力强 ,至培养 2 8天时达到最大增殖倍数 30 0多 ,表型分析结果表明 ,CD3+ CD5 6 + 双阳性细胞得到了大量的扩增 ,其含量由原来的 0 2 3%上升到第 2 1天的 17 8%。体外实验表明 ,肝癌患者的CIK细胞杀伤自体原代肝癌细胞的细胞毒活性明显高于自体的PBMC细胞。裸鼠体内实验表明 ,CIK细胞能够显著抑制肿瘤的生长 ,其抑瘤率可达84 7% ,高于LAK细胞的 5 2 8%及PBMC的 37 1% (P <0 0 5和P <0 0 1)。结论 :CIK细胞具有较强的体内外抗肝癌细胞活性 ,有可能应用于临床上肝癌的过继性免疫治疗。

蛇床子中3种逆转肿瘤细胞多药耐药活性香豆素

目的 从蛇床子 Cnidium monnier中分离逆转肿瘤细胞多药耐药活性成分。方法 用生物活性跟踪法 ,经硅胶柱层析、RP- HPL C等。结果 分离得到 3种活性成分 ,分别为欧芹属素乙 (im peratorin) ,爱得尔庭 (edultin) ,9-异丁酰氧基 - O-乙酰基哥伦比亚苷元 (3′- isobutyryloxy- O- acetyl columbionetin)。结论 体外实验表明 3种化合物对耐药的肿瘤细胞 KBV2 0 0具有明显的逆转作用。

小鼠Egr-1基因调控序列的克隆及其辐射诱导特性的鉴定

Egr-1(early growth response-1)系-具有辐射诱导特性的转录因子.其调控序列被证实可通过与肿瘤杀伤基因相连接的方法而赋予后者以辐射诱导特性,因而被用于肿瘤的基因-放射治疗研究.为此,我们用PCR方法从BALB/c小鼠基因组DNA扩增出445bp长Egr-1基因调控序列,序列分析证实,除-392位一个碱基(A→G)相差外,其余均与文献报道一致,包括6个对辐射诱导特性起关键作用的CC(A+T)_6GG结构域-将克隆的Egr-1基因调控序列连入pCL3荧光素酶报告质粒,转染小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16),转染细胞用^(60)Coγ-线进行2.5、5.0和10.0Gy不同剂量照射后,检测细胞裂解液中荧光素酶活性.与未照射细胞比较.照射后细胞荧光素酶活性明显提高,以2.5Gy剂量最为显著.提高约138%,表明Egr-1基因调控序列具有辐射后诱导下游基因表达的功能.

重组人肝再生增强因子在体外能刺激HTC肝癌细胞DNA合成

在成功克隆人肝再生增强因子（hALR）CDNA的基础上，本研究将人ALR编码区cDNA亚克隆于真核瞬间表达质粒pCDNAⅠ，构建了真核表达质粒pCDNAⅠ－hALR，转染cos-7细胞后，表达产物生物活性检测表明：真核表达的hALR在体外能刺激HTC肝癌细胞增殖，这一体外活性的确定为重组人ALR的纯化提供了简洁、可靠的检测方法。

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

骨髓间充质干细胞的增殖、分化及迁移等生物学特性受骨髓微环境的调节。肝细胞生长因子(HGF)是骨髓微环境分泌的主要因子之一,但它对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响并不清楚。本研究目的是观察重组人HGF对骨髓MSC生物学特性的影响。用免疫组织化学方法检测cMet的表达,用MTT法测定细胞增殖,定量测定ALP的活性,进行细胞迁移分析和失巢凋亡(anoikis)诱导MSC凋亡分析。结果表明,重组人HGF不影响骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨细胞的分化,但可明显促进骨髓间充质干细胞的迁移并抑制anoikis诱导的细胞凋亡;PI3K和MAPK途径参与了HGF促进细胞迁移的作用。结论:肝细胞生长因子通过受体cMet影响骨髓间充质干细胞的生物学特性。

微载体悬浮培养成人骨髓间充质干细胞

本研究采用微载体旋转培养系统和常规静止培养系统对成人骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcell,MSC)的培养进行比较。MSC是贴壁依赖性细胞 ,旋转培养系统采用CultiSpherG大孔微载体 ,浓度为 1g L ,常规静止培养在 12孔培养板中进行。两系统细胞接种密度均为 5× 10 4 cells ml。结果 :旋转培养 7天后达到最大活细胞密度5 .15 0× 10 5cells ml,常规静止培养第 5天就达到最大活细胞密度 1.6 75× 10 5cells ml。在微载体旋转培养中生成乳酸12 .0 6mmol L ,而常规静止培养中生成乳酸 13.10mmol L ,葡萄糖消耗分别为 7.38mmol L和 5 .37mmol L。在微载体旋转培养中平均乳酸产率为 1.6 3,远低于常规静止培养的平均乳酸产率 2 .4 4。这些表明 ,在微载体悬浮培养条件下 ,MSC生长更为旺盛 ,细胞产量更高 ,葡萄糖消耗和能量利用率优于常规静止培养。微载体悬浮培养 12天后 ,MSC依然保持其干细胞特性。结论

OSM对黑色素瘤的抑制作用与基因-放射治疗效果

目的 :探讨OSM对黑色素瘤体内生长的抑制作用及其在基因 放射治疗中的应用。方法 :用重组的人OSM基因表达质粒 (pO)和辐射诱导性OSM表达质粒 (pEO)转染小鼠B16黑色素瘤细胞 ,筛选OSM表达细胞 (pO 17和pEO 1) ,皮下接种C5 7BL/ 6小鼠 ,观察和比较相同生长期内瘤体重量及给予60 Coγ 线局部照射后肿瘤抑制率的变化。结果 :在未照射实验中 ,pO 17和pEO 1细胞接种 2 0d后的瘤体重量较对照组明显降低 ;在照射实验中 ,pEO 1细胞照射后 7d后瘤体重量的下降最为显著 ,肿瘤抑制率由未照射时的 33.8%提高至 48.1%。结论 :转基因分泌的OSM可对瘤细胞的体内生长产生抑制 ;射线可通过Egr 1R增强OSM表达的途径加剧肿瘤抑制 。

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进

背景:脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能,以及取材方便等优点而日益受到关注。目的:建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法,并对其生物学特性进行分析。方法:无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带,利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,即将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养,取第3代脐带间充质干细胞进行生物学特性分析。结果与结论:组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出,第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中继续培养,2 d后即可见有细胞爬出,细胞生长速度较快,5 d即可形成细胞克隆。传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。细胞增殖能力旺盛,平均倍增时间为50 h左右,41.24%的细胞处于G2/S期。体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性,而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。

肝部分切除后肝再生增强因子信使核糖核酸(mRNA)表达增强

肝再生增强因子（ALR）是一种新的肝增殖刺激因子。本研究选择70％肝部分切除（PH）大鼠为模型，观察了PH后残存肝组织胞浆液促肝细胞增殖活性与ALR特异mRNA表达动态变化的关系。发现正常肝组织几无ALRmRNA表达，其肝胞质液也无促肝细胞增殖活性；70％PH后12h肝组织AthmRNA表达明显增加，并于术后24h达高峰，肝胞质液活性也于术后24h内达高峰，这种mRNA表达一效应的时间关系提示：ALR可能是一种重要的生理性肝再生调控因子。

携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备

构建一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(AdHGF),并对其进行扩增、纯化与质量检测。首先构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1CMV/pAHGF,然后用LipofectAMIN介导该质粒和含有E1、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒GT4050共转染293细胞,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺病毒(AdHGF)。并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒,PCR法鉴定阳性重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu/ml)。采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果成功构建了重组腺病毒AdHGF,制备的病毒纯度好、滴度高,其效价比小于1∶100,并且未检测到有复制能力的腺病毒存在。研究构建制备的重组腺病毒AdHGF具有潜在的实际应用价值。

离子交换高效液相色谱法分析质粒pUDKH

采用阴离子交换高效液相色谱法监测重组质粒pUDKH的生产过程和该质粒产物中超螺旋pUDKH的比例。所用的色谱条件为:色谱柱TSKgelDNA NPR(4 6mmi d ×75mm);流动相体系由20mmol/LTris HCl(pH8 8)和1mol/LNaCl组成,梯度洗脱方式。分析结果表明:质粒产物中超螺旋pUDKH含量达95%(质量分数)以上时,检测不到残留的核糖核酸(RNA)。高效液相色谱法检测质粒pUDKH产物及其生产过程的灵敏度高、试样用量少,分辨率高。

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列存在多态性的推论．在此基础上应用ＤＮＡ重组技术，将去信号肽中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子下游，转化大肠杆菌ＤＨ５α，通过温度诱导表达，成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，其表达水平占全菌可溶性总蛋白的４４．４％，初步复性后生物学活性测定结果表明γ－ＩＦＮ表达量为０．４５×１０￣７～２．３４×１０￣７单位／Ｌ．

胎儿肝脏中一种抑制HL-60细胞生长的因子初步研究

胎儿肝脏中存在着两类抑制HL-60细胞生长的抑制物,一类是精氨酸酶,它是一类非特异性的细胞毒剂,在我们的实验条件下,不仅对HL-60细胞,而且对正常人骨髓CFU-GM也具有相似的抑制细胞生长的毒性作用。此外,还存在着一类较小分子的抑制物,它对HL-60细胞生长的抑制作用明显高于对人骨髓CFU-GM的作用,因此,在一定程度上,这是一类对HL-60细胞生长具有选择性作用的抑制物。

高效液相色谱法测定广金钱草中vicenin-2的含量

广金钱草为常用中药，来源于豆科山蚂蝗属植物Desmodium styracifolium(Osbeck)Merr.的干燥地上部分，收载于中国药典(2000年版，一部)。产于广西、广东、福建等省。具有清热除湿，利尿通淋之功效。用于热淋、砂淋、石淋，尿路结石等。在民间用来治疗肾、肝、胆结石已有百余年历史。

腺病毒介导多基因在肺癌细胞中的表达及致凋亡效应

目的:观察重组腺病毒介导入野生型p53,B7-1和GM-CSF基因在肺癌细胞中的表达及致调亡效应.方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将入野生型P53,B7-1和GM-CSF基因导入肺癌细胞,分别以免疫组织化学法、流式细胞分析法和ELJSA法检测了外源基因在肺癌细胞中的表达,通过苔盼蓝染色后计数活细胞数绘制细胞生长曲线,末端标记法检出细胞凋亡.结果:观察到重组腺病毒分导的多种外源基因均可在肺癌细胞中高效表达,并可明显抑制肺癌细胞增殖并诱导其凋亡.结论:以上工作为进一步开展肺癌的多基因治疗打下了基础.