乳酸脱氢酶A促进人脉络膜黑色素瘤细胞的生长

目的成功构建带有Flag标签的人乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的真核表达载体,初步检测LDHA基因对人脉络膜黑色素瘤(choroidal melanoma,CM)MUM-2B细胞生长功能的影响。方法将军事科学院传代培养的人CM系随机分为实验组和对照组,实验组MUM-2B细胞瞬时转染构建成功带有Flag标签的人LDHA重组质粒(Flag-LDHA),对照组MUM-2B细胞瞬时转染Flag空载质粒;以带有GST标签的Flag-LDHA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增LDHA基因,并将其插入到Flag载体,应用菌液PCR、双酶切和测序方法鉴定重组质粒,鉴定成功后瞬时转染人CM,通过Western blot鉴定其表达;CCK8法检测并绘制生长曲线。结果PCR技术扩增得到长约1000 bp的LDHA基因的编码区序列,并成功克隆至Flag载体上;与对照组相比,实验组菌液PCR结果为阳性,双酶切鉴定结果为切开两条长约4000 bp的Flag载体和1000 bp的LDHA基因条带,测序鉴定结果为插入的序列与LDHA基因的编码序列完全一致。Western blot检测结果显示,与对照组相比,实验组MUM-2B细胞成功表达LDHA蛋白;CCK8法检测结果显示,实验组MUM-2B细胞较对照组MUM-2B细胞生长快。结论成功构建了Flag-LDHA真核表达载体,并发现LDHA基因能够促进人CM MUM-2B细胞的生长,为研究LDHA在人CM的发生发展中的功能奠定基础。

吴茱萸次碱对高糖诱导的阿尔茨海默病大鼠认知障碍的影响

目的:探讨吴茱萸次碱对高糖诱导的阿尔茨海默病(AD)大鼠认知功能障碍的影响及其机制。方法:健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(n=20):对照组、高糖组和吴茱萸次碱组。对照组大鼠行常规饲料和自来水饲养;高糖组大鼠行常规饲料和20%蔗糖水饲养;吴茱萸次碱组行0.01%吴茱萸次碱饲料和20%蔗糖水饲养。三组大鼠饲养24周后行Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆和认知功能,Westernblot实验检测各组大鼠tau蛋白在Thr205和Ser214位点以及GSK-3β在丝氨酸9位点糖原合成酶激酶-3β(S9-GSK-3β)和PP2A在络氨酸307位点蛋白磷酸酯酶-2A(Y307-PP2A)的磷酸化水平;免疫组织化学进一步验证各组大鼠大脑海马和皮层tau蛋白在Thr205位点上的表达情况。结果:与对照组比较,高糖组Morris水迷宫大鼠潜伏期明显升高,穿越平台次数和目标象限停留时间均明显降低(P均<0.05),免疫组织化学染色中tau蛋白在Thr205位点上的磷酸化水平显著增高(P<0.05),Westernblot实验tau蛋白在Thr205和Ser214位点的磷酸化水平显著增高,pS9-GSK-3β的磷酸化水平显著降低(P均<0.05);与高糖组相比,吴茱萸次碱组Morris水迷宫大鼠潜伏期明显降低,穿越平台次数和目标象限停留时间明显升高(P均<0.05),免疫组织化学染色中tau蛋白在Thr205位点的磷酸化水平显著降低(P<0.05);Westernblot实验tau蛋白在Thr205和Ser214位点磷酸化水平显著降低,pS9-GSK-3β的磷酸化水平显著增高(P均<0.05)。结论:吴茱萸次碱可减轻高糖诱导的AD样大鼠认知功能障碍,其机制可能是通过增强海马pS9-GSK-3β磷酸化水平,下调GSK-3β活性,进而降低tau蛋白相关位点的过度磷酸化实现的。

Deoxygedunin对D-半乳糖联合AlCl_3诱导大鼠阿尔茨海默病病理性改变的影响

目的:观察Deoxygedunin对D-半乳糖联合Al Cl3诱导的阿尔茨海默病模型大鼠Aβ沉积、学习记忆和氧化应激的影响及其可能机制。方法:健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(n=12):对照组(Control)、模型组(AD)和干预组(AD+Deo)。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆和认知功能;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠海马组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;免疫组织化学检测大鼠大脑皮层tau蛋白表达情况; Western blot实验用于检测Trk B信号通路上ERK1、AKT和Trk B蛋白的表达。结果:水迷宫结果显示,与对照组相比,D-半乳糖联合Al Cl3诱导的大鼠逃避潜伏期显著增加(P<0.05)。Deoxygedun-in可逆转模型组逃避潜伏期的增加(P<0.05)。在去除平台的第7日,与对照组和干预组相比,模型组大鼠表现出逃避潜伏期增加(P<0.01),穿越平台次数较少(P<0.05);免疫组织化学和ELISA实验结果显示,与对照组相比,模型组Aβ、tau蛋白表达显著增加(P<0.01),SOD、GSH-Px活性显著降低,MDA含量明显升高。与模型组相比,Deox-ygedunin可逆转模型组Aβ、tau蛋白表达的增多(P<0.01),SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05); Western blot结果显示,Deoxygedunin干预可逆转模型组海马Trk B、AKT和ERK1的磷酸化水平的降低。结论:Deoxygedunin可通过激活Trk B信号转导通路显著逆转Aβ沉积,氧化应激和认知缺陷,提示Deoxyge-dunin可能作为减轻D-半乳糖联合AlCl3诱导AD样病理功能障碍潜在的治疗备选药物。

过敏性鼻炎患者外周血Tfhs中ICOS的表达及ICOS阻断剂对Tfhs IL-21表达的影响

目的研究过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者外周血滤泡性辅助T细胞(follicular helper T cells,Tfhs)中可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator molecule,ICOS)的表达情况及ICOS阻断剂对AR患者外周血Tfhs IL-21表达的影响。方法收集AR患者和健康人(healthy controls,HCs)的外周血,流式细胞仪检测HCs和AR患者外周血中Tfhs ICOS表达水平及ICOS阻断剂对AR患者外周血Tfhs IL-21表达的影响。结果AR患者外周血中Tfhs的数量和ICOS+Tfhs的比例显著高于HCs(P<0.05)。此外,ICOS阻断剂可显著抑制AR患者外周血Tfhs分泌IL-21(P<0.05)。结论AR患者外周血Tfhs的数量及ICOS表达升高,ICOS阻断剂可抑制Tfhs分泌IL-21,提示Tfhs可能通过ICOS相关机制参与AR发病。

带FLAG标签的CDK4真核表达载体构建及对喉癌细胞的影响

目的构建带Flag标签的pc DNA3. 0载体细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase,CDK4)的真核表达载体,验证该基因对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。方法以人乳腺文库为模板采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出CDK4的CDS区编码序列,应用双酶切将带Flag标签pc DNA3. 0载体插入到PCR产物上,转化DH5α提取质粒,测序正确后转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CDK4基因的转录水平,蛋白质印迹鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法和克隆形成实验测定其对喉癌Hep-2细胞生长的影响。结果 pc DNA3. 0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功;提取质粒转染Hep-2细胞,qRT-PCR技术检测到该基因在Hep-2中转录水平明显增高;蛋白质印迹实验验证该基因蛋白成功表达; CCK-8法和克隆形成实验证明CDK4基因可促进Hep-2细胞增殖。结论 pc DNA3. 0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功并验证该基因促进喉癌细胞增殖,为进一步研究该基因在喉癌中的发生发展奠定了前期基础。