Wingless/Wnt信号与缺血性脑中风中神经血管单元相关的研究进展

Wingless(Wnt)信号通路作为一个复杂的蛋白质作用网络,通过自分泌和旁分泌作用调节多种细胞的发生和发育,具有重要的生物学意义。近年来针对神经和血管的整体保护,提出了神经血管单元(neurovascular unit,NVU)的新模型,并发现Wnt信号通路在缺血性脑中风神经血管单元保护中可能发挥重要作用。Wnts家族与卷曲蛋白(Friz-zled)/低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipopro-tein related proteins 5/6,LRP5/6)结合,进入细胞内,经过一系列反应,可激活核内缺氧诱导因子-1α(hypoxia induciblefactor-1α,HIF-1α),在基因水平上直接调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达(Wnt信号可作为HIF-1α和VEGF的上游信号),继而上调β-catenin信号分子,激活其下游信号分子从而调节血脑屏障(blood brain barrier,BBB)及NVU相关基因和蛋白的水平,即从整体上促进缺血性脑中风损伤后修复。

基于氨基酸代谢的抗脑缺血益气解毒配伍中药协同作用研究

目的首次从氨基酸代谢的角度探讨有前期基础，针对缺血性脑中风确有疗效的新的益气解毒方3个组分人参总皂苷、盐酸小檗碱和栀子苷的协同作用机制，探索中药整合作用研究的新方法。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO），通过RRLC-QQQ同时测定脑缺血12h后大鼠血清中12种内源性氨基酸的含量，结合神经行为学评分，以及单因素方差分析、偏最小二乘判别分析和主成分分析等数据分析方法，对不同给药剂量（5、25mg·kg-1）下的益气解毒方3组分的不同给药组合对氨基酸水平的调控作用进行综合评价。结果益气解毒方3组分共同给药组（5、25mg·kg-1）中大鼠的神经行为学评分均明显降低，特别是对于Glu、Asp、Met、Hcy和Phe5种氨基酸的水平调控明显，与模型组相比差异具有显著性（P〈0．05，P〈0．01）。通过主成分分析方法对不同给药组合的贡献度进行评价的结果显示，给药量为25mg·kg-1各组中PCI、PC3、PC4三个主成分和给药量为5mg·kg-1各组中PCI-PC5及PC7六个主成分中贡献度最大的给药组合均为益气解毒方3组分共同给药组。结论益气解毒方3组分配伍对于脑缺血后内源性氨基酸水平调节具有较好协同作用，三者共同给药可明显改善脑缺血后内源性氨基酸的代谢水平异常，其作用优于两两组合或是任意单一组分给药，相比而言，人参总皂苷在总方中可能较栀子苷、盐酸小檗碱发挥更重要的作用。

高良姜素对缺血性脑卒中大鼠脑线粒体代谢相关酶的影响

目的:观察高良姜素对缺血性脑卒中大鼠脑线粒体能量代谢相关ATP酶的影响,探讨高良姜素通过干预线粒体能量代谢障碍发挥缺血性脑卒中保护作用的可能机制。方法:将120只雄性SD大鼠随机分成两大组,即术前给药组和术后给药组,每大组中又分为假手术组、模型组、阳性药银杏叶提取物EGb761组(mg·kg-1)及高良姜素高、中、低剂量组(100,50,25 mg·kg-1),每组10只。大鼠行中动脉栓塞手术前15 min或者术后6 h灌胃给药或给予等量生理盐水,于手术后24 h进行神经功能学评分,制备缺血侧脑组织线粒体悬液,并对其Na+-K+ATP酶,Ca2+-ATP酶,Mg2+-ATP酶,Ca2+-Mg2+ATP酶活性进行检测。结果:高良姜素中剂量和高剂量组,Na+-K+ATP和Ca2+-Mg2+ATP酶活性均有明显提高(P<0.05),低剂量组酶活性无明显改变;相比较,Ca2+-ATP酶,Mg2+-ATP酶活性各组之间没有明显的差别。结论:高良姜素能明显提高缺血性脑卒中大鼠脑线粒体Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性,缓解缺血脑细胞的能量代谢障碍,是其发挥脑缺血保护作用的可能机制之一。

细胞培养稳定同位素标记技术的发展及其在脑病研究中的应用

寻找脑中特异的蛋白标记物,对于脑病临床诊断及药物机制研究至关重要。人脑是一个复杂的有机体,采用单靶点、非动态、局部的方法不适于脑病研究,而以质谱技术为基础的定量蛋白质组学的出现和发展,加快了脑病标志分子的研究进程。细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)作为精确的蛋白定量方法,是系统、动态的研究方法,为脑病机制和治疗脑病中药的研究提供了新的思路。

小儿咽扁颗粒抗急性咽炎药理作用研究

目的:根据小儿咽扁颗粒的临床适应证,研究小儿咽扁颗粒对于急性咽炎的治疗作用,证明其疗效,并初步分析其作用环节。方法:采用咽部氨水喷雾的方法,诱发大鼠急性咽炎(Acute Pharyngitis),观察小儿咽扁颗粒对急性咽炎大鼠免疫功能、血清炎性反应因子的影响以及对咽部黏膜的保护作用。结果:连续给药7d后,模型组与正常组比较,大鼠表观指标评分比较,差异有统计学意义(P<0.05);小儿咽扁颗粒低剂量组可显著性降低表观指标评分。连续给药7d后,病理学指标结果显示小儿咽扁颗粒低、中、高剂量组可不同程度改善咽部炎性反应情况。血清炎性因子检测结果显示,小儿咽扁颗粒不同剂量组可不同程度降低血清炎性因子TNF-α浓度(P<0.05;P<0.01)。结论:小儿咽扁颗粒对急性咽炎大鼠有增强免疫功能、降低血清炎性反应因子的作用,对咽部黏膜有一定保护作用。

益气解毒方基于线粒体保护的抗缺血性脑卒中研究

目的:基于线粒体呼吸功能,研究益气解毒方对缺血性脑卒中的保护作用。方法:采取大鼠中脑动脉闭塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),造模前15 min给予益气解毒方及相应拆方,造模12 h后,取材,提取脑组织线粒体,检测线粒体三态呼吸速率、四态呼吸速率、磷氧比、呼吸控制率、氧化磷酸化率等指标,评价益气解毒方对缺血性脑卒中的保护效果。此外,通过主成份分析(Principal Component Analysis,PCA)和变量重要性指标(Variable Importance in Projection,VIP),评价益气解毒方各组分在抗缺血性脑卒中的作用效果。结果:益气解毒方能改善缺血性脑卒中病理过程中线粒体呼吸相关的各项指标,益气解毒方各拆方对缺血性脑卒中也有较好的改善作用。PCA结果显示,与各拆方组比较,益气解毒方全方的治疗效果最好;在各拆方组中,人参皂苷和黄连素配伍后的效果最好。VIP分析结果显示,益气解毒方基于保护线粒体呼吸功能来改善缺血性脑卒中的病理过程中,黄连素的贡献度最大。结论:益气解毒方能够显著降低缺血性脑卒中病理过程中所造成机体损伤,其机制可能与保护线粒体功能有关。

鱼腥草破壁饮片对内毒素致热家兔的解热作用研究

目的:考察鱼腥草破壁饮片对内毒素致家兔发热的解热作用及血液中内毒素含量,血清中炎性因子含量的影响。方法:采用家兔耳缘静脉注射内毒素制备家兔发热模型,测量给药前及给药后4 h各组家兔体温,观察鱼腥草破壁饮片对致热家兔体温的影响;4 h后,耳缘静脉采血,检测全血中白细胞数量,血浆中内毒素含量,以及用ELISA法检测血清中炎性反应因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。结果:与对照组比较,模型组体温、全血中白细胞含量、血浆中内毒素含量以及血清中IL-1β,IL-6、TNF-α的含量均显著增高。与模型组比较,鱼腥草破壁饮片高、中剂量组能显著地降低致热1 h后的家兔体温;并且,其可显著降低全血中白细胞含量、血浆中内毒素含量。与鱼腥草传统饮片组比较,鱼腥草破壁饮片可显著降低致热1 h后的家兔体温、全血中白细胞含量以及血清中IL-6的含量,差异有统计学意义。鱼腥草破壁饮片和传统饮片均可不同程度降低IL-1β、TNF-α含量。结论:鱼腥草破壁饮片可显著清除家兔体内内毒素,使其体温下降,且在一定程度上优于传统饮片。

2G型肢带肌营养不良症斑马鱼疾病模型的构建

目的构建2G型肢带肌营养不良症(LGMD2G)斑马鱼疾病模型,并初步探讨其致病机制。方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术进行sgRNA制备、显微注射、tcap基因纯合突变斑马鱼筛选,构建tcap基因功能缺失的纯合突变斑马鱼。通过石蜡切片和苏木精-伊红(HE)染色观察野生型(WT)斑马鱼和tcap基因纯合突变斑马鱼的骨骼肌肌原纤维形态。使用新一代斑马鱼游泳速度测试系统检测WT斑马鱼(A组)和tcap基因纯合突变斑马鱼(B组)的最大游泳速度。将WT斑马鱼胚胎分别经空白处理、漂白剂处理、剪切损伤处理、加兰他敏处理,分别作为C、D、E、F组,采用原位杂交实验检测C~F组斑马鱼胚胎tcap mRNA表达情况。再将WT斑马鱼胚胎和M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎分为WT斑马鱼胚胎空白对照组(G组)、WT斑马鱼胚胎加兰他敏处理组(H组)、M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎空白对照组(I组)和M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎加兰他敏处理组(J组),应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测C~F组斑马鱼胚胎tcap mRNA相对表达量,检测G~J组斑马鱼胚胎p53和p21 mRNA的相对表达量。结果核酸电泳结果显示成功合成了长约100 bp的斑马鱼tcap基因编辑所需sgRNA;DNA测序结果显示筛选获得了2种tcap基因纯合突变斑马鱼。HE染色实验结果显示,与WT斑马鱼相比,tcap基因纯合突变斑马鱼的骨骼肌肌原纤维明显紊乱。斑马鱼最大游泳速度检测实验结果显示,相较于A组,B组斑马鱼的最大游泳速度显著降低(t=3.32,P<0.05)。原位杂交实验结果显示,与C组相比,D~F组斑马鱼胚胎中tcap mRNA表达量明显增加。RT-qPCR实验结果显示,C~F组斑马鱼胚胎中tcap mRNA相对表达量比较差异有显著性(F=21.70,P<0.05),其中D~F组明显高于C组(t=4.95~35.44,P<0.05);G~J组斑马鱼胚胎中p53和p21 mRNA相对表达量比较差异有显著性(F=8.45、33.04,P<0.05),其中J组明显低于H、I组(t=3.24~8.94,P<0.05)。结论成功构建了tcap基因功能缺失斑马鱼LGMD2G模型,tcap基因功能缺失导致p53基因下调可能是LGMD2G致病机制之一。

解偶联蛋白在脑缺血疾病中的作用研究进展

解偶联蛋白(uncoupling proteins,UCPs)是一类位于线粒体内膜上的阴离子载体蛋白,属于线粒体载体蛋白超家族。到目前为止,已经发现并确认UCPs同系物为5种,即UCP1～UCP5,中枢神经系统中主要含有UCP2,UCP4和UCP5 3种亚型,已经证实其对于脑缺血后的氧化应激、线粒体膜电势及ATP绝对水平的维持具有重要的作用,本文主要将UCPs在脑缺血疾病中相关作用进行综述,希望可以为脑缺血疾病的治疗提供新的研究思路。

马应龙八宝眼霜的抗炎作用及对血流量的影响

目的:探讨马应龙八宝眼霜对黑眼圈的改善作用。方法:本实验通过SD大鼠右后足足跖注射角叉菜胶致足肿胀,外涂2%,1%,0.5%马应龙八宝眼霜,观察不同时间足跖肿胀度及给药前后足跖质量差,评价其抗炎作用;使用激光散斑血流监测视频系统监测SD大鼠耳廓血流,观察大鼠耳廓涂抹马应龙八宝眼霜后对血流的影响。结果:马应龙八宝眼霜具有一定的抗炎作用;并且具有不同程度的降低耳廓血流灌注量的作用。结论:马应龙八宝眼霜通过抗炎、降低血流量的作用可能对黑眼圈具有一定的改善作用。

益气解毒方对局灶性脑缺血大鼠线粒体损伤的保护作用

目的探讨益气解毒方及其各组分对局灶性脑缺血大鼠脑组织线粒体的保护作用。方法将SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药物银杏叶提取物(EGb761)对照组(4 mg/kg)和益气解毒方、人参总皂苷、黄连素、栀子苷各高、中、低3个剂量组(25、5、1 mg/kg)。大鼠行中动脉栓塞(MCAO)手术前15 min灌胃给药或给予等量生理盐水,手术后24 h进行神经行为学评分,制备缺血侧脑组织线粒体悬液并对其形态及功能指标进行评价。结果与假手术组相比,模型组神经功能学评分显著升高(P<0.01);与模型组相比,益气解毒方高、中、低剂量组及单个组分高剂量组的神经行为学评分均显著降低(P<0.05或P<0.01),且各给药组线粒体的功能均得到不同水平的改善,均可不同水平的改善损伤线粒体的功能;益气解毒方与单组分相比,对局灶性脑缺血大鼠神经行为学及损伤线粒体功能的改善作用更为明显,且呈一定的浓度依赖关系。结论益气解毒方可发挥较好的线粒体保护作用,可能是其发挥抗脑缺血、治疗缺血性脑中风的重要机制,且相对于3个单一组分(人参总皂苷、黄连素、栀子苷)而言,由3个组分组合而成的益气解毒方对各项指标均发挥着相对较好的药理效应,说明益气解毒方组合用药,与单组分给药相比,可更好的发挥整合治疗作用。

益气解毒方对大鼠局灶性脑缺血氧化应激的影响

目的:研究中药益气解毒方对大鼠局灶性脑缺血后氧化应激损伤的影响。方法:取健康雄性SD大鼠60只,随机分为6组:假手术组、模型组、阳性药银杏叶提取物组(4 mg.kg-1)、益气解毒高、中、低剂量组(25,5,1 mg.kg-1)。给药组于手术麻醉前10 min灌胃给药,用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,12 h后取血清和缺血脑组织制备组织匀浆液,用酶标仪定量检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、单胺氧化酶(MAO)、髓过氧化物酶(MPO)。结果:与假手术组比较,模型组脑组织SOD和GSH-Px活性明显降低(P<0.01),MDA含量和MAO,MPO活性明显升高(P<0.05)。与模型组比较,益气解毒方高、中、低剂量组、阳性药组SOD和GSH-Px显著性升高(P<0.01),MAO,MDA和MPO显著性降低(P<0.05,P<0.01)。结论:益气解毒方对大鼠局灶性脑缺血有保护作用,其作用机制可能与抗氧化应激作用有关。

应用快速分离色谱-串联质谱(RRLC-QQQ)定量分析脑缺血后脑组织中内源性氨基酸的含量

目的:基于RRLC-QQQ建立脑缺血后脑组织中未衍生化的内源性氨基酸的含量测定方法。方法:采用DiamonsilC18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,15 min内同时测定12种氨基酸。乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱,流速为0.5 mL.min-1。离子源为ESI,正离子扫描模式,扫描方式为多反应检测。结果:各氨基酸标准曲线在检测范围内均呈良好线性(r>0.996),其检测限低于1.53μg.L-1,定量限低于3.09μg.L-1,高中低3个浓度水平日内和日间精密度的RSD均小于11%。结论:实际样品测定结果表明与假手术组相比,在脑缺血病理状态下,除N-乙酰天门冬氨酸外,脑组织中其余氨基酸水平均升高。部分氨基酸有显著变化,变化水平在术后12,24 h呈时间依赖性。该方法简便,快速,灵敏。这种方法可以应用于寻找脑缺血生物代谢标记物,探索研究脑缺血分子机制以及中药多成分组合药物协同作用机制。

鱼腥草破壁饮片抗细菌内毒素作用研究

目的考察鱼腥草破壁饮片抗内毒素(LPS)作用,并与传统饮片作用进行比较。方法采用BALB/c小鼠鼻滴LPS建立肺部炎症模型,检测血液中炎症细胞数和病理学观察肺组织炎症程度;采用尾iv内毒素致大鼠炎症模型,检测血液中白细胞数和血浆中LPS含量,酶联免疫法(ELISA)检测血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量;采用鲎试剂试验法,观察鱼腥草破壁饮片提取物体外抗细菌内毒素作用。结果鱼腥草破壁饮片和传统饮片均可不同程度降低BALB/c小鼠全血中白细胞含量,减轻肺组织病理炎症细胞浸润,且破壁饮片呈明显的剂量依赖关系;鱼腥草破壁饮片与传统饮片均可不同程度显著降低大鼠全血中白细胞、血浆中内毒素和血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量;与传统饮片比较,鱼腥草破壁饮片可明显降低血清中IL-1β、TNF-α含量;相同剂量或相同稀释比例下,鱼腥草破壁饮片体外抗细菌内毒素作用均显著强于鱼腥草传统饮片。结论鱼腥草破壁饮片具有良好的抗内毒素作用,且在一定程度上优于鱼腥草传统饮片。