栝楼籽核糖体失活蛋白的纯化、性质及晶体生长研究

栝楼（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉ）籽经粉碎抽提、硫酸铵沉淀、阳离子交换及凝胶过滤柱层析等步骤，得到一种单链核糖体失活蛋白－Ｔｒｉｃｈｏｋｉｒｉｎ（ＴＣＫ）．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ显示为单一条带，其分子量为２９ｋＤ，ｐＩ≥９．３，含糖量约为１．７５％．该蛋白对兔网织红细胞裂解液系统的蛋白质合成具较强的抑制活性，ＩＣ５０为６．７×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ．改进了纯化方法，提高了产率，并培养出晶体．

丝瓜核糖体失活蛋白的分离与纯化

采用一种改进的方法，简便快速地从丝瓜（Ｌｕｆｆａｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）籽中得到丝瓜蛋白α和β．它们在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均呈一区带，其分子量分别为２８０００和２９０００．等电聚焦测定等电点均为１０．它们对无细胞体系蛋白质合成都有强烈的抑制活性，其ＩＤ＿（５０）分别为１０μｇ／Ｌ和５０μｇ／Ｌ，是目前发现的单链核糖体失活蛋白中活性最高的．

(E160A)和(E160D)天花粉蛋白两种突变体晶体结构研究

培养了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ和（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ的单晶。在ＭＡＲＲｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．１９３ｎｍ和０．２０ｎｍ分辨率的Ｘ射线衍射数据。数据处理用ＭＡＲＳＣＡＬＥ程序系统完成。用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了突变体的晶体结构，结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序。修正结果，晶体学Ｒ因子分别为０．１７５，０．１７９，键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１１ｎｍ和２．４５７°，０．００１３ｎｍ和２．６７５°。在这两个突变体的结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变。通过对（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ和（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ的结构比较，说明（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ活性低于（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ的原因：这可能是由于在（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ中Ｔｙｒ１１１和Ｔｙｒ７０的侧链都具有较大的运动性，使它们与腺嘌呤碱基的芳香堆垛作用减弱。

天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术，对天然天花粉蛋白（ｎＴＣＳ）基因在Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２两个保守残基处同时进行定点突变，即Ｔｙｒ１４变成Ｐｈｅ，Ａｒｇ２２变成Ｌｅｕ，然后克隆到ｐＥＴ－８ｃ高效表达载体上，构建成重组质粒ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ．经序列分析，定点突变的结果与预先设计的完全一致，突变后的天花粉蛋白命名为Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ．将ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ转化到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）中，进行表达．经ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，纯度可达９０％．ＲＩＰ活性测定显示，Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ的活性比ｎＴＣＳ降低了７．５倍，活性变化不显著，因此，ＴＣＳ的Ｔｒｙ１４和Ａｒｇ２２对维持其活性部位构象并不是必需的．但由于Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达量与ｎＴＣＳ相比明显下降，因此，Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２可能与ＴＣＳ翻译后的折叠有关．

栝楼籽核糖体失活蛋白(TCK)与天花粉蛋白(TCS)性质比较研究

建立了从栝楼种籽大规模制备核糖体失活蛋白（ＴＣＫ）的方法。进行了ＴＣＫ与天花粉蛋白（ＴＣＳ）性质比较研究。

沙棘果肉和叶中黄酮类化合物组份的比较研究

用HPLC方法测定了沙棘果和沙棘叶中黄酮类化合物的组成和含量,并揭示了果和叶中黄酮类化合物组份的差异.

沙棘和葡萄籽中原花青素的对比研究

用高效液相色谱 (HPLC)法对沙棘籽和葡萄籽中的原花青素进行了比较研究 ,发现沙棘籽可以作为除黄酮以外又一多酚类抗氧化剂——寡聚原花青素 (OPC)的原料 ,OPC在医疗保健、食品。

杂氮硅三环化合物(Ⅰ)和(Ⅱ)晶体结构的研究

杂氮硅三环化合物Ⅰ(■-COOCH_(2)Si(OCH_(2)CH_(2))_(3)N)和Ⅱ(■OCH_(3),COOSi(OCH_(2)CH_(2))_(3)N)的分子结构用直接法解,经全矩阵最小二乘修正,得到它们的晶体学参数。并对它们的结构进行了比较和讨论。

天花粉蛋白Glu160在N-糖苷酶活性中的作用

用浸泡法得到了（Ｅ１６０Ａ）天花粉蛋白（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， ＴＣＳ），（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ与Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ与ＦＭＰ复合物的晶体．在Ｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 面探测器系统上分别收集了０．２０ ｎｍ ，０．１９ｎｍ 和０．２０５ ｎｍ 分辨率的Ｘ 射线衍射数据，数据处理用Ｍａｒ Ｓｃａｌｅ 程序系统完成．用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－Ａｄｅ，（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ－Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－ＦＭＰ的晶体结构，结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序，修正结果，晶体学Ｒ因子分别为０．１６６，０．１７６，０．１７９．键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１０ ｎｍ 和２．５０３°，０．００１３ ｎｍ 和２．６６５°，０．００１２ ｎｍ 和２．６７６°．在这三个结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变．Ａｄｅ 或ＦＭＰ仍结合在Ｎ－糖苷酶活性口袋之中，它夹在Ｔｙｒ７０和Ｔｙｒ１１１两个侧链环之间，与Ｔｙｒ７０环近乎平行．这一结果表明：ＴＣＳ中的Ｇｌｕ１６０分别突变成Ａｌａ 和Ａｓｐ，仍能与ＡＭＰ发生Ｎ－糖苷酶反应，但是活性降低了一些．可见Ｇｌｕ１６０对ＴＣＳ与ＡＭＰ的作用是重要的，但不是必要的．

天花粉蛋白Glu189在N-糖苷酶活性中的作用

培养了(E160A,E189A)TCS(天花粉蛋白)的单晶。用浸泡法得到了(E160A,E189A)TCS与Ade复合物的晶体。在MarResearch面探测器系统上分别收集了均为0.20nm分辨率的X射线衍射数据,数据处理用MarScale程序系统完成。用同晶差值Fourier法解析了(E160A,E189A)TCS和(E160A,E189A)TCS-Ade的晶体结构,结构修正利用X-PLOR程序.修正结果,晶体学R因子分别为0.180、0.184,键长和键角的RMS偏差分别为0.0012nm和2.566°、0.0012nm和2.622°。在(E160A,E189A)TCS-Ade中,Ade仍结合在N-糖苷酶活性口袋之中,它夹在Tyr70和Tyr111两个侧链环之间,与Tyr70环近乎平行。这一结果表明:TCS中的Glu160和Glu189同时突变成Ala,仍能与AMP发生N-糖苷酶反应.前文已经证明在(E160A)TCS中Glu189没有援救作用。目前,没有发现Glu189对TCS与AMP的直接作用,但Glu189与其它残基的协同作用及其在TCS与rRNA作用中扮演什么角色,尚待进一步研究。

栝楼籽核糖体失活蛋白的纯化及性质研究

用改进的方法从栝楼籽制得一种单链核糖体失活蛋白（ＴＣＫ），研究其性质，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ显示为单一条带，分子量为２９ｋＤ，ｐＩ≥９．３，含糖量约为１．７５％。在兔网织红细胞裂解液系统中对蛋白质合成有较强的抑制活性，ＩＣ５０为６．７×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ。

天花粉蛋白与FMP复合物的晶体结构

用浸泡法得到了天花粉蛋白（ＴＣＳ）与ＦＭＰ复合物的晶体，在ＳＩＭＥＮＮＳＸ－２００Ｂ面探测器系统上收集了一套２．０分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了复合物的结构，经Ｘ—ＰＬＯＲ程序修正得到了ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物的分子结构并找出了１９７个水分子，最后的Ｒ因子为０．１７２，键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．０１５和２．９２２度。ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物中，ＦＭＰ与天花粉蛋白分子有较好的结合，其结合位置正处于根据三维结构和突变体信息推测的Ｎ一糖苷酶活性口袋之中。它的类嘌呤环夹在Ｙ７０和Ｙ１１１两个侧链环之间，与Ｙ７０环近乎平行，其Ｎ７和Ｎ６分别与ＴＣＳ分子的Ｇ１０９４羰基氧和Ｉ７１的Ｎ成氢键，Ｎ３靠近Ｒ１６３的侧链，其磷酸根则伸向活性口袋的底部，与Ｅ１８９、Ｅ１６０和Ｒ１６３等残基作用。

neo Trichosanthin及其突变体Y70A neo Trichosanthin的晶体结构研究

天花粉蛋白（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ，ＴＣＳ）的一个亚型，ｎｅｏＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ（ｎ－ＴＣＳ），及其突变体Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ被克隆和表达为重组蛋白。用悬滴汽相扩散法得到ｎ－ＴＣＳ和Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ的晶体。在ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２０ｎｍ和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了结构。最后晶体学Ｒ因子分别为０．１８３和０．１８４。键长的ｒ．ｍ．ｓ．偏差分别为０．００１６ｎｍ和０．００１４ｎｍ，键角的ｒ．ｍ．ｓ．偏差分别为２．９３０°和２．７３２°。ｎ－ＴＣＳ虽然与ＴＣＳ有１１个氨基酸的差别，但它们都不是活性口袋区的关键残基。并且这些氨基酸的替换绝大多数属于保守替换。和ＴＣＳ相比，这１１个残基及其附近残基的主链间形成的保守氢键在ｎ－ＴＣＳ中没被破坏，它们所处的二级结构也保持不变。所以ｎ－ＴＣＳ的整体结构与ＴＣＳ十分相近。Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ的晶体在收集数据前曾用含５＇ＡＭＰ的缓冲液浸泡过，活性口袋区没发现可与Ａｄｅｎｉｎｅ相匹配的密度。用ＨＰＬＣ检测Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ与５＇ＡＭＰ作用后产物，层析图谱上相应位置也没有出现Ａｄｅｎｉｎｅ。上述结果表明，７?

亚天花粉蛋白突变体(R163H n-TCS和R163Q n-TCS)的晶体结构研究

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ６１３Ｑｎ－ＴＣＳ的晶体，在Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２００和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ－射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构，用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正，最后的晶体学Ｒ因子分别为０．１８４和０．１８５，键长偏差分别为０．００１３ｎｍ和０．００１４ｎｍ，键角偏差分别为２．５９０°和２．８１５°。结构测定显示Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ１６３Ｑｎ－ＴＣＳ与ｎ－ＴＣＳ的主链结构无较大变化，活性口袋区的结构和氢键体系发生了明显变化。生化分析表明Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ具有糖苷酶活性，Ｒ１６３Ｑｎ－ＴＣＳ没有糖苷酶活性。这说明，第１６３位侧链的Ｈ＋对ｎ－ＴＣＳ发挥Ｎ－糖苷酶活性至关重要。

亚天花粉蛋白突变体R163Kn-TCS及其复合物R163Kn-TCS/Ade的晶体结构

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ的晶体， 并用ＡＭＰ 浸泡４８ 小时后得到复合物晶体。在Ｍａｒ－ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 面探测器系统上分别收集了０ ．２０５ 和０ ．１８７ｎ ｍ 分辨率的Ｘ－ 射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构，用Ｘ－ ＰＬＯＲ 软件包进行修正，最后两模型的偏差因子（Ｒ 和Ｒｆｒｅｅ） 分别为（０．１８７ 和０．２６３） 和（０．１８０ 和０．２３３） ，键长偏差都为０ ．００１３ｎｍ ， 键角偏差分别为２ ．７０８°和２ ．５８４°。结构测定显示Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ 和Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ／Ａｄｅ 的主链结构无较大变化活性口袋区的结构和氢键体系发生了明显变化。生化分析表明Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ 具有糖苷酶活性，但活性降低。这说明，第１６３ 位侧链的Ｈ＋ 对ｎ － ＴＣＳ发挥Ｎ－ 糖苷酶活性至关重要。

管状胃在食管、贲门癌手术中的临床应用

目的探析管状胃技术在食管癌和贲门癌手术中的应用效果以及推广价值。方法该次实验将该院胸外科于2011年7月1日—2013年7月1日收治135例患者作为研究对象。利用回顾性分析的方法对此135例患者的临床资料进行分析。按照手术方法的不同将所有患者分为实验组A和实验组B。实验组A70例食管、贲门癌患者运用胸腔胃进行手术治疗。实验组B65例运用管状胃的手术方法进行治疗。观察统计两组食管、贲门癌患者的吻合口瘘发生率、并发症发生率、住院时间、手术时间、患者满意度等情况。以具体探析管状胃在食管癌和贲门癌手术中的推广价值。结果通过统计分析两组食管、贲门癌患者的临床资料。可以看出实验组A与实验组B的住院时间、手术时间等情况相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。实验组A的70例患者中,有7例肺部感染的发生并发症情况,并发症发生率为10.00%,而实验组B的65例患者中,只有1例肺部感染的发生并发症情况,并发症发生率仅为1.54%,两者差异有统计学意义(P<0.05);而实验组A和B的患者满意度分别为85.71%和98.46%,实验组B的满意度也明显更高(P<0.05)。结论通过管状胃的建立,可以大大减少食管、贲门癌患者手术后的并发症发生率。且与胸腔胃相比住院时间、手术时间等没有明显弱势。因并发症大大减少,患者的满意率也明显提高。且管状胃更适应人体生理状态。管状胃在食管、贲门癌患者的手术治疗过程中有十分重要的应用价值。

Y14F/R22L天花粉蛋白的晶体结构研究

Y14F/R2 2LTCS的晶体结构是用同晶差值Fourier法解得 .经X_PLOR程序修正得到Y14F/R2 2LTCS的分子结构 ,并找到了 6 5个水分子 .对 0 2 3nm分辨率衍射数据的晶体学R因子为 0 185,键长和键角的rms偏差分别为 0 0 0 12nm和 2 6 52° .在Y14F/R2 2LTCS中 ,Tyr14变成Phe ,Phe周围变化很小 ,α5的弯折依然存在 ;Arg2 2变成Leu ,余下的空间被水分子 2 56所占据 ,水分子 2 56与Ala16 1,Ala16 2的主链氧成氢键 ,部分代替Arg的作用 .并讨论了二级结构间保守氢键的作用 .

Y14F天花粉蛋白的晶体结构研究

核糖体失活蛋白（Ribosome inactivating protein,RIP）是广泛存在于植物界的蛋白毒素,天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）又是该家族中的一个重要成员。TCS及其同源蛋白的高分辨率晶体结构为进行结构与功能关系的研究打下了良好的基础,通过对同源蛋白的结构比较发现在结构中存在着很保守的氢键。为了探讨这些保守氢键对结构与功能的影响,我们用基因定位突变的方法,对形成保守氢键的残基进行突变,测定这些突变体的活性与晶体结构,可以加深我们对这些保守氢键所起作用的认识。TCS中Tyr14的羟基与Ser157的主链氧之间形成保守氢键,这一氢键在螺旋α5的弯折处,而且Ser157的主链碳基氧明显偏离了正常螺旋中的与螺旋轴平行的方向,这一现象在已知的RIPs结构中都存在。为了考察这一保守氢键对螺旋α5弯折的形成所起的作用,我们将Tyr14突变为Phe,这样突变后将保留芳香环侧链的特性,突变后的构象变化主要来自这一保守氢键的消失。

天花粉蛋白N-糖苷酶作用的机制

用晶体学方法分别研究了TCS与AMP ,Ado ,tub ,CMP的相互作用 .确证了TCS专一性识别Ade,嘧啶环不识别 ,而用TCS与单核苷酸作用 ,磷酸根存在与否并不重要 ;R1 6 3胍基的H+被Ade的N3共享 ,而不是N7接受质子 .丰富了TCS与AMP相互作用的N 糖苷酶作用机制模型 .此模型也应该适用于RIPs与AMP的相互作用 ,反映了RIP与rRNA作用的基本模式 ,但是 ,RIP与rRNA的作用会更复杂 ,要全面了解RIPs对rRNA的识别与催化 ,还应该探索RIP与rRNA中包括GAGA茎环区底物类似物复合物的三维结构 .

天花粉蛋白与单核苷酸作用机制的研究

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是一个Ⅰ型核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein,RIP)。亦是一个能使28SrRNA的4324位腺苷酸水解掉腺嘌呤碱基的N-糖苷酶。晶体结构测定和突变体活性测试,确定了两结构域之间分子表面凹陷区就是它的N-糖苷酶活性口袋,并为结构与功能研究提供了扎实的基础。为探索RIPs的N-糖苷酶作用机制,杨洁等人做了TCS-FMP,TCS-Ade(AMP的产物,腺嘌呤)复合物的晶体结构;Xiong等人做了TCS-NADPH复合物的晶体结构;Ren等人做了αMMC-FMP,αMMC-Ade复合物的晶体结构;