新型培养体系下小肠类器官模型的构建

目的构建具有损伤再生能力的新型小肠类器官,体外模拟肠道损伤、再生和修复过程。方法分离6~8周龄、18~24 g无特定病原体动物级C57BL/6小鼠回肠黏膜隐窝结构,设计ENR、ENR+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和8C培养体系,分别构建肠道稳态、炎症损伤和损伤再生条件下的小肠类器官并观察形态。通过免疫荧光染色检测类器官包含的细胞类型和空间排布,以及损伤再生基因凝集素蛋白(Clu)、膜联蛋白A1(Anxa1)、干细胞抗原1(Sca1)和小鼠再生胰岛衍生蛋白3β(Reg3 b)的蛋白质表达情况。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Clu、Anxa1、Sca1、Reg3 b的mRNA表达情况。统计学方法采用独立样本t检验。结果8C和ENR培养体系下的小肠类器官均包含肠道干细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠道内分泌细胞,细胞空间排布与肠上皮基本一致。8C培养体系下的新型小肠类器官的扩增能力较ENR、ENR+TNF-α培养体系下的小肠类器官明显增强,生长速度更快,结构更大、更复杂。qRT-PCR结果显示,8C培养体系下的新型小肠类器官再生基因Clu、Anxa1和Sca1的mRNA相对表达水平均高于ENR和ENR+TNF-α培养体系(0.68±0.31比0.20±0.07、0.36±0.19,0.48±0.13比0.07±0.02、0.18±0.11,0.56±0.20比0.02±0.01、0.08±0.04),差异均有统计学意义(t=4.82、2.77,8.62、4.89,8.58、7.50;均P<0.05)。免疫荧光检测显示,8C培养体系下的新型小肠类器官再生基因Clu、Anxa1、Sca1和Reg3 b的蛋白质表达水平均高于ENR、ENR+TNF-α培养体系(31.62±1.69比9.73±2.39、15.11±2.16,42.65±1.85比19.70±1.18、24.97±2.82,63.80±2.73比37.10±1.59、43.27±2.53,53.26±1.84比27.75±3.78、33.16±3.50),差异均有统计学意义(t=12.95、10.41,18.13、9.09,14.63、9.56,10.51、8.80;均P<0.001)。结论新型培养体系下建立的小肠类器官具备损伤再生特征,为研究上皮组织器官再生提供了新的体外模型。