小麦TaMAPK1基因的克隆及其功能研究

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长发育与逆境应答过程中具有重要作用。为探究小麦MAPK基因在植物生长发育中的作用,利用生物信息学分析其编码蛋白的序列和结构,发现该基因编码的蛋白含有一个保守的催化丝氨酸/苏氨酸磷酸化的激酶结构域,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。系统进化分析结果表明,小麦MAPK基因与拟南芥MAPK1为直系同源基因,故将其命名为TaMAPK1。进一步通过转基因方法创建了以野生型拟南芥Col-0为背景的TaMAPK1过表达株系(TaMAPK1-OE)和以拟南芥AtMAPK1基因功能缺失纯合突变体mapk1为遗传背景的TaMAPK1回补系(TaMAPK1-com),并对其进行表型观察和产量性状调查,结果发现,突变体mapk1的抽薹时间比Col-0提前2.8 d,TaMAPK1-com的抽薹时间与Col-0无显著变化;与Col-0相比,突变体mapk1的株高、总分枝数、种子大小、单株种子重量和单株生物量均显著提高,而TaMAPK1-com和TaMAPK1-OE株系的种子大小、单株和种子重量和单株生物量均显著减少。

朱顶红褪绿环斑病毒云南君子兰分离物S序列的克隆及分析

利用RT-PCR以及ELISA对采自云南省昆明市的君子兰样品进行鉴定,确定了其病原物为朱顶红褪绿环斑病毒(hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)。这是首次在君子兰(Clivia miniata)中检测到番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒,为明确其序列特征,设计了HCRV S RNA全序列扩增引物,进一步克隆了该分离物的S RNA全基因组序列,并进行了序列分析。结果表明,HCRV-CM分离物S RNA全长2 749 nt(Gen Bank登录号:KY484836),与已报道的HCRV基因结构一致。基于核壳体蛋白N基因序列的系统进化分析显示HCRV-CM与来自云南的HCRV株系聚为一支,说明HCRV-CM与HCRV云南分离物亲缘关系较近。

云南不同地区蜘蛛兰上朱顶红褪绿环斑病毒RNA S序列分析

朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)是2013年首次发现并报道的番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的新种,该病毒可引起蜘蛛兰产生同心环纹、叶片畸形、坏死斑等症状。本研究从云南省不同地区选出6份HCRV单独侵染的蜘蛛兰样本,通过RT-PCR、克隆、转化、测序和拼接,获得6份样本的HCRV分离物RNA S序列。6个分离物S序列长度在2 714~2 747 nt之间,其上编码的非结构蛋白NSs(Nonstructural protein by the S RNA)的NSs基因是1 332 nt,编码N(Nucleocapsid)蛋白的N基因是825 nt。通过生物信息学分析,确定了不同HCRV株系间的关系。同时对S RNA序列及其所编码的非结构蛋白NSs及核壳体蛋白N进行突变和重组分析,确定这6个HCRV分离物的RNA S序列均存在突变和重组事件。结合6个分离物采集地的环境信息,可以看出气候类型、温度等环境差异很大,因此推测云南省多样的气候类型跟HCRV在云南省的广泛分布有关,在这6个HCRV分离物中检测到的快速突变和重组可能是导致HCRV快速适应不同环境,分布范围广泛的原因之一。最后,通过系统进化分析,推测采集自云南省保山市的HLSTCRH是6个HCRV分离物中最先开始进化的,由它分为两个进化支,一支包括玉溪的YN-YX-HT-1和德宏瑞丽的HLS-YNRL-1,另一支包括昆明的HLS-YL,红河的HLS-HHXY以及临沧的HLS-LC-YLHW。

侵染昆明园林植物的4个HCRV分离株核壳体蛋白氨基酸序列分析

【目的】比较分析侵染昆明园林植物HCRV核壳体蛋白氨基酸序列,探究地理分布和寄主来源与病毒变异的相关性。【方法】2016年,在云南省昆明市园林景区采集疑似感染番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒样品,利用RT-PCR技术测定出葱莲(Zephyranthes candida)、文殊兰(Crinum asiaticum)、喜林芋(Philodendron schott)和酢浆草(Oxalis corniculata)4份感染朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)的样品,通过克隆、测序获得4份样品的S RNA序列,利用ORF Finder获得核壳体蛋白(nucleocapsid protein,N)并进行序列分析。【结果】文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV新寄主;4个HCRV分离物的N蛋白与NCBI首次报道的HLS1-2 N蛋白(登录号:AFX74694)一致性达到99.34%;系统进化树分析显示:4个HCRV分离物与GenBank公布的同样来自云南的株系聚为1支。【结论】病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。

小麦miR5062靶基因的鉴定及功能研究

miRNA作为一种植物中重要的内源小分子,通过调控靶基因的表达来行使其功能。为了探索小麦(Triticum aestivum)中新发现的miRNA tae-miR5062的靶基因,利用生物信息学方法对tae-miR5062的靶基因进行预测和进一步分析,将属于小麦AGO2家族的TaAGO2确定为其靶基因;进一步构建重组表达载体pBI121-pre-miR5062和pBI121-TaAGO2,分别转入农杆菌GV3101感受态细胞,然后在烟草叶片上分区注射进行农杆菌介导的烟草瞬时共转化实验。结果表明,tae-miR5062与其靶基因TaAGO2互作降解,并降低了TaAGO2的表达。利用实时定量PCR方法检测TaAGO2在小麦不同组织中的转录水平,结果显示,TaAGO2在小麦根和叶中表达量不高,但在旗叶、茎、穗、籽粒和生长点中都有较高的表达。将C端连有GFP的TaAGO2融合表达载体转入水稻黄化苗叶鞘的原生质体后瞬时表达的亚细胞定位结果显示,TaAGO2蛋白定位于细胞核和细胞质中;与拟南芥过量表达TaAGO2的转基因植株相比,野生型对照并无明显的表型。