人未成熟朗格汉斯细胞的分选及鉴定

目的分离并鉴定健康人皮肤组织内未成熟状态的朗格汉斯细胞(LC)。方法把取得的人包皮组织剪成特定大小后采用分散酶Ⅰ(dispaseⅠ)消化过夜,分离表皮和真皮;Ⅰ型胶原蛋白酶在37℃消化表皮组织2 h并结合摇床振荡制成单细胞悬液,通过特异性的分子标志物,应用流式细胞仪分选获得人CD3^-CD14^-CD1a^+CD45^+LC,采用免疫荧光技术检测CD207的表达对其进行鉴定,并用台盼蓝染色检测其活力。结果分选得到未成熟LC,纯度为91. 31%,平均存活率为93. 16%。结论成功分选获得活力好、纯度高的未成熟人LC。

单纯疱疹病毒2型衣壳支架蛋白ICP35原核表达载体的构建及其表达特性分析

本研究旨在构建单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)衣壳支架蛋白ICP35的原核表达载体,并分析其在HSV-2增殖中的表达特性。以HSV-2基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSV-2 ICP35的编码基因UL26.5,并克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,将纯化的重组ICP35免疫家兔后获得抗体,采用免疫荧光检测ICP35在HSV-2增殖中的表达特性。结果显示,HSV-2 UL26.5基因的PCR产物大小约为1065 bp,原核表达重组蛋白的相对分子质量约为6.3×10^(4),免疫家兔的血清抗体可特异性识别HSV-2 ICP35。免疫荧光检测结果显示,HSV-2 ICP35可在感染后8 h出现于细胞核周围,12 h表达量进一步增加并向细胞核内聚集,16 h后在细胞核、细胞质内均可检测到聚集成斑点状的衣壳支架蛋白。结果表明,HSV-2 ICP35原核表达载体的成功构建及对其在HSV-2增殖中表达特性的分析,将为研究UL26.5基因的功能、蛋白相互作用、病毒与宿主的相互作用及筛选药物靶标等奠定基础。

us3基因的缺失对单纯疱疹病毒1型毒力和抗凋亡功能的影响

利用CRISPR/Cas9系统使单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) ul7、ul41、LAT 基因缺失构建M3减毒株(M3株),在M3株基础上通过缺失 us3 得到M4突变株(M4株)。本研究旨在分析野毒株(McKrae株)、M3株与M4株在毒力和抗细胞凋亡方面的差异。结果表明,McKrae组出现明显的临床症状,且100%死亡(P<0.001),而M3、M4组未出现临床症状。M4组小鼠组织中病毒载量明显低于McKrae组和M3组;病理学检测表明,McKrae组出现蛛网膜出血、胶质小结等现象,而M3、M4组未见病理损伤,M4组炎性因子表达与McKrae、M3组相比也显著下降(P<0.01);免疫后M4组较M3组出现高水平的中和抗体、γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)抗原特异性T细胞;McKrae株再次感染时,M4组小鼠组织中病毒载量明显低于对照组和M3组;在人急性T细胞淋巴瘤细胞中,M4株相比McKrae株和M3株可明显诱导细胞凋亡。

BALB/c小鼠经不同途径感染单纯疱疹病毒Ⅱ型的病理学比较分析

目的比较BALB/c小鼠经不同途径感染单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)后的病理学变化.方法分别采用经阴道、鼻腔和眼角膜3种不同的攻毒方式使BALB/c小鼠感染HSV-2,观察小鼠的临床表现及攻毒部位和神经组织的病理变化,检测神经组织中的病毒载量.结果鼻腔组小鼠无明显症状,但至观察期结束仅有27.27%的存活率;阴道组小鼠表现不同程度的外阴炎以及体质量下降等症状,观察至感染后8d,小鼠的存活率已为0;角膜组小鼠表现不同程度的角膜炎,观察期结束存活率仍有63.64%.病理变化结果显示,鼻腔组小鼠仅脑组织存在明显的病理变化;阴道组和角膜组小鼠攻毒部位均发生明显的病理变化,但阴道组小鼠脑和脊髓均可见明显的病理变化.神经组织病毒载量检测结果表明,与对照组相比,3个实验组小鼠脑和脊髓中HSV-2的病毒载量均显著升高,且随着感染时间的增加而升高.结论BALB/c小鼠经3种不同途径感染HSV-2均可引起小鼠不同程度的病理学变化.本研究为HSV-2感染引发的神经系统疾病的发病机制研究提供了理论基础.

体外研究脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应系统的作用及其免疫学意义

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应信号分子的影响,了解脊髓灰质炎病毒在上皮细胞中启动免疫信号的具体分子机制。采用PCR方法扩增脊髓灰质炎病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,经酶切纯化后与pcDNA3.1+真核表达载体连接,分别构建含目的基因的四种重组质粒。将重组质粒分别转染至人呼吸道上皮细胞16HBE中,48h后收集培养上清、细胞。提取细胞的总RNA,利用Q-PCR法分别检测四种结构蛋白表达所诱导的天然免疫信号分子的mRNA表达量。同时,上清、细胞裂解物分别与人T细胞共培养,检测其对T细胞增殖的影响。体外在16HBE细胞中分别表达SabinⅠ病毒VP1～VP4四种结构蛋白均可刺激如LTα3、NIK等NF-κB天然免疫信号通路相关分子的表达,并且表达这四种蛋白的细胞裂解物与T细胞共培养后均表现出刺激T细胞非特异性增殖的效应。但是,仅有VP1、VP2表达所诱导分泌相关因子的培养上清才表现出间接刺激T细胞增殖的能力。SabinⅠ毒株的四种结构蛋白可激活NF-κB信号通路,促进T细胞的非特异性增殖,从而激活适应性免疫应答。

柯萨奇病毒B组2型(CVB2)病毒蛋白转染上皮细胞后诱导的免疫应答信号分子的特征分析

目的分析柯萨奇病毒B组2型(coxsackievirus B2,CVB2)病毒蛋白转染上皮细胞后诱导的免疫应答信号分子特征。方法构建CVB2结构蛋白重组真核表达质粒转染16HBE细胞,收集转染后的16HBE细胞培养上清和裂解物。利用RT-Q-PCR技术检测转染后的16HBE细胞中与固有免疫应答相关的信号分子的mRNA表达水平。利用ELISPOT检测转染后的16HBE细胞上清和裂解物与T细胞共培养后该T细胞的增殖效应。结果CVB2结构蛋白VP1~VP4转染16HBE细胞后与固有免疫相关的信号分子如TAK、NIK、IKKα、IFN-β等基因表达量均发生了不同程度的上调;CVB2 VP1~VP4转染后的16HBE细胞上清和裂解物与T细胞共培养发现,均能刺激T细胞增殖。结论CVB2结构蛋白VP1~VP4可以不同程度地激活与固有免疫相关信号分子的表达,并且对适应性免疫的激活具有促进作用。