塔宾曲霉固态发酵产物中α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析

α-L-鼠李糖苷酶是一种在食品、药品中有重要用途的糖苷酶,但其结构与功能关系尚不明确,限制了优良酶制剂的设计。本文通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和亲和层析从塔宾曲霉固态发酵柚皮产物中分离纯化得到了一种α-L-鼠李糖苷酶,纯化倍数和比活力分别为34和21105 IU/mg,SDS-PAGE测得该酶的分子质量为120 ku;纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶最适反应p H为4.0,最适反应温度为50℃,p H稳定性和热稳定性好;Fe^(2+)对酶活有促进作用,Mn^(2+)、Ca^(2+)、Cd^(2+)对酶有抑制作用;该酶可水解柚皮苷,但对芸香苷和对硝基苯酚鼠李糖的转化率较低,不水解杨梅苷和柴胡皂苷C。以上结果表明纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶在金属离子影响特性、底物特异性方面具有新颖性,丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系研究素材。

黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷分子动力模拟研究

α-L-鼠李糖苷酶能够水解柚皮苷生产普鲁宁和L-鼠李糖,可用于柑橘类果汁的脱苦处理。对柚皮苷和黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶进行分子对接,采用分子动力模拟和MM-PBSA结合的方法计算对接复合物的结合自由能,并分析了分子间相互作用以及各个残基对结合自由能的贡献。结果表明范德华作用力是黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷结合的主要驱动力,库伦电荷作用和非极性溶剂化能对结合贡献较小。Trp236、Ala340、Ile462、Phe461、Tyr516、Val522、Trp528等是黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶和柚皮苷结合过程中形成疏水作用的重要氨基酸残基。在分子动力模拟平衡后的氢键分析中,黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶Ser286、Phe465、Pro520残基和柚皮苷共形成了3个稳定的氢键。本研究分析了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷结合的驱动力,以及结合过程中重要氢键及疏水性残基,为蛋白质工程改造α-L-鼠李糖苷酶提供了靶位。

多点突变提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性,对实验室前期构建的K406R、K440R、K573V、E631F四个不同氨基酸位点的单点突变体进行联合突变,得到了K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F四个联合突变体。结果表明,相比于野生型(wild type,WT),联合突变体K440R-K573V和K440R-E631F的热稳定性有所提高,在60℃时半衰期分别提高了1. 13倍,1. 44倍;在65℃的半衰期分别提高了1. 64倍,1. 64倍;在70℃的半衰期分别提高了1. 88倍,1. 68倍。对突变体K440R-E631F进行圆二色谱分析、分子动力学以及分析微观结构变化分析可知,K440R-E631F突变体与WT相比,内部疏水性有所提高,二级结构中α-螺旋、"-转角、无规则卷曲含量增多,可能与热稳定性的提高相关。

黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶Rha1的二级结构预测及三级结构模拟

本文研究了酶的结构,有利于进一步了解酶的功能,通过对α-L-鼠李糖苷酶Rha1二级结构分析及三级结构模拟,为该酶进行理性设计提供基础。采用GORⅢ、PHD等九个二级结构预测方法对Rha1的二级结构进行分析和预测。结果显示,Rha1二级结构为23.51%α-螺旋,29.77%β-折叠,46.71%无规则卷曲,具有一个与GH78家族相似的(α/α)6桶状结构域及两个β三明治折叠片结构域。利用Swiss-Model以单模板建模的方法构建了Rha1的三维结构模型。根据二级结构的结果,将Rha1分为三个结构域,利用Modeller 9.15以多模板分段建模、结构域拼接的方法构建了该酶的三维结构模型,并对其进行能量最小化优化。利用Ramachandran图以及Verify_3D评估对两种方法构建得到的Rha1的三维结构模型进行评价,其中Swiss-Model构建得到的模型未通过评价,Modeller9.15构建得到的Rha1的三维模型结构合理,通过评价。α-L-鼠李糖苷酶Rha1模型的构建为今后深入研究该酶的结构与功能奠定了基础。

GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶分子系统进化关系分析

为了分析糖苷水解酶第78家族(glucoside hydrolase family 78,GH78)中真菌α-L-鼠李糖苷酶保守区及进化关系,本研究应用Clustal W2软件对87条GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶进行多重序列比对,利用Block Maker进一步分析,得到了该家族真菌的共有完全氨基酸保守位点及保守区;利用Signal P 4.1 Server对序列进行信号肽预测;应用MEGA 6.0软件对Clustal W2结果进行遗传距离分析并构建分子系统进化树。GH78家族真菌87条序列虽然长度不等,但均包含AHGWSTGPTY、VTLDTGQNVAG和NELSIPTDGAKRD 3个保守区及多个完全保守氨基酸位点;87条序列中29条含有信号肽;属间遗传距离为0.7~48.5,种间遗传距离为0.4~48.5;分子系统进化树并不是依靠菌株来源进行聚类,而是依据是否为胞外酶进行聚类。该研究分析了GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶的保守区及进化关系,为α-L-鼠李糖苷酶的工程改造奠定了基础。