贵州小型香猪皮肤成纤维细胞库的构建

目的:小型猪与人的皮肤组织结构相似,探索一种贵州小型香猪成纤维细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定方法为组织工程皮肤的构建奠定基础。方法:采用细胞培养技术和组织工程学方法。结果:采用细胞培养技术将贵州小型香猪成纤维细胞传代至23代,此时的细胞数至少是原代培养的细胞数的1×109倍,经冻存、复苏后,猪成纤维细胞仍具有增殖能力,生长状态与原代培养的猪成纤维细胞相类似。结论:通过细胞培养技术和组织工程学的方法可以成功地构建贵州小型香猪成纤维细胞库。

猪复合人工皮肤组织工程学研究:小型香猪角质形成细胞库的构建

目的:小型香猪与人的皮肤组织结构相似,是研究人皮肤良好的动物模型,构建贵州小型香猪角质形成细胞库,为构建猪组织工程皮肤做好准备工作。方法:采用分离酶和胰蛋白酶联合消化法分离小型香猪角质形成细胞,角质形成细胞培养基培养。结果:小型香猪角质形成细胞呈“铺路石”样生长,可连续传代,实验结束时成功地将角质形成细胞传至第13代。传代及冻存、复苏后的角质形成细胞保持了与原代细胞相同的生长状态,并具有继续传代能力。结论:作者通过细胞培养和组织工程学的方法,建立了小型香猪角质形成细胞库。

猪复方壳多糖组织工程皮肤替代物的构建

目的:采用组织工程方法,在鼠尾胶原中加入壳多糖及培养的贵州小型香猪成纤维细胞与角质形成细胞,进行猪复合壳多糖组织工程皮肤替代物的构建。方法:实验于2001-09/2002-12在解放军第三军医大学大坪医院完成。①实验所需皮肤标本取自3月龄雌性贵州小型香猪4只,取新鲜全层皮肤于D-Hanks平衡盐液浸泡,将标本剪成0.3cm×2.0cm皮条,4℃消化14～16h后备用。②消化后的标本分离表皮和真皮,分别用于角质形成细胞和成纤维细胞的分离培养。以传代培养的猪角质形成细胞和成纤维细胞作为种子细胞,以加入壳多糖、糖胺聚糖等天然细胞外基质的鼠尾胶原作为真皮基质,于钢丝网上进行气液界面培养,苏木精-伊红染色观察培养物的结构。结果:①角质形成细胞的培养情况:接种的猪角质形成细胞于培养第2天可见细胞贴壁生长,形成细胞集落,15d左右融合成片,呈“铺路石样”。②真皮成纤维细胞的培养情况:消化法接种的猪成纤维细胞培养两三天后即见细胞贴壁生长,10d左右基本融合,呈旋涡状生长。③猪真皮基质浸没培养的变化情况:刚制备的真皮基质呈红色,倒置显微镜下凝胶各层面均可见尚未恢复形态的成纤维细胞。3d后随着凝胶的收缩,人工真皮逐渐与培养板壁和底分离,透光度下降,不易见到凝胶中的细胞。真皮基质的收缩发生于第3天,第6～12天真皮基质的直径最大收缩到45%左右,以后逐渐减慢。④猪的复合皮肤替代物的培养情况:培养第3天在真皮基质上加入传代后的猪角质形成细胞,其上可见薄的角质形成细胞层。浸没培养6d后角质形成细胞层色素逐渐加深。气液界面培养14d后的人工皮肤有一定的弹性、韧性以及抗拉力和抗挤压力。⑤复方壳多糖组织工程皮肤的光镜观察结果:镜下表皮可明显区分基底层、棘层和角化不全的角质层,共有7～12层细胞。真、表皮连接有起伏,真皮中可见较多的成纤维细胞,真皮支架结构紧密。结论:成功构建具有真、表皮结构的双层猪组织工程皮肤替代物,与正常猪皮肤的形态结构相似,真皮结构致密,表皮分化良好,为组织工程皮肤的临床应用奠定实验基础。

人肌腱胶原蛋白的提取及凝胶制备

目的探索人肌腱胶原蛋白在组织工程皮肤及整形外科中的应用。方法从人肌腱提取酸溶性胶原,制备人肌腱胶原蛋白。结果所提取的胶原在pH5.8左右迅速形成凝胶。光镜下可见酸溶性胶原纤维呈长细丝状,交织成网状。纯度以羟脯氨酸质量分数为基准,分光光度法测定为95%。氨基酸成分主要为甘氨酸占35%,脯氨酸占10%。结论氨基酸分析表明,所提取的胶原为典型的Ⅰ型胶原蛋白,热稳定性测定Td为39～41℃。

组织工程皮肤自体及异体移植后表皮分化及重建的动物实验研究

目的研究猪组织工程皮肤移植后表皮层角蛋白分化标志的变化情况,为组织工程皮肤临床应用提供实验依据。方法按本科已建立的方法构建猪的组织工程皮肤,进行自体及同种异体移植实验,并于移植后1周、4周、8周取标本,行组织学检查和免疫组化染色,观察移植后组织工程皮肤表皮层角蛋白的表达、表皮细胞分化和重建情况。结果猪组织工程皮肤自体及同种异体移植后均存活,创面达到理想的愈合效果;组织学检查显示表皮分化良好,表皮层广谱角蛋白抗体免疫组化染色阳性;基底层以上细胞角蛋白K10抗体免疫组化染色阳性;基底层细胞角蛋白K5抗体免疫组化染色阳性。结论构建的猪组织工程皮肤自体及同种异体移植后,可获得理想的创面愈合效果,表皮分化和再构建良好,与正常皮肤相似。本实验为组织工程皮肤临床应用提供了有力的实验依据。

人毛囊细胞来源双层皮肤替代物的构建和组织学特征

目的探索人毛囊细胞构建的双层皮肤替代物的组织学特征。方法用毛乳头细胞、真皮鞘细胞分别与外根鞘细胞构建复合壳多糖双层皮肤替代物,分析其体外和移植至大白鼠后的组织学特征。结果毛囊来源细胞构建的皮肤替代物中表皮细胞排列更紧密、角化突出,真皮内可见与表皮相连的上皮细胞柱及球形膨大细胞团形成。结论毛囊细胞是构建皮肤替代物的良好细胞来源。

人角质形成细胞库的建立

目的 探索人皮肤表皮细胞分离、培养、传代、冻存及复苏技术。方法 采用细胞培养技术及免疫组化染色鉴定技术。结果 采用细胞培养技术体外分离培养了小儿包皮表皮细胞 ,培养的表皮角质形成细胞 ,经冻存、复苏后 ,此角质形成细胞仍既能增殖 ,又能分化 ,生长状态与新鲜分离的角质形成细胞相类似。

异体角质形成细胞免疫原性的初步研究

目的观察组织工程皮肤的种子细胞角质形成细胞体外培养后的免疫原性变化情况。方法取自愿捐献的健康儿童、青少年包皮,采用分离酶、胰蛋白酶两步消化法进行体外培养并传代至5代,行苔盼蓝计数细胞活性。SP法标记各代角质形成细胞中的朗格汉斯细胞和黑色素细胞,计算其占总细胞数的百分比。各代角质形成细胞与从外周血中分离培养淋巴细胞进行混合培养,观察淋巴细胞增殖情况,闪烁仪计数cpm值。结果培养的细胞生长良好,原代及传代后的细胞融合后呈铺路石样生长。细胞冻存后复苏,苔盼蓝染色细胞活力>80%。原代中朗格汉斯细胞占5.8%,黑色素细胞占8.1%;1代中朗格汉斯细胞占2.1%,黑色素细胞占2.8%;2代后二者均消失。cpm值原代482.13±46.61,1代362.50±35.12,2代228.38±51.46,3代171.86±34.63,4代143.63±15.95,5代123.25±14.39,与对照组53.67±8.61比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。原代、1代与其他各代比较,2代与4、5代比较,差异均有统计学意义(P<0.05);2代与3代间,3、4代及5代间,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论异体角质形成细胞经体外培养后不断传代,细胞免疫原性逐渐下降。

皮肤组织工程的基础研究:三磷酸腺苷酶染色法定性及定量观察猪表皮朗格汉斯细胞

目的:观察三磷酸腺苷ATP)酶染色的猪表皮朗格汉斯细胞密度和形(态。方法:用改良的JuhlinATP酶染色法,对小型香猪表皮进行染色,显示朗格汉斯细胞。结果:猪表皮朗格汉斯细胞为棕黑色树突状,测得猪腹部表皮的朗格汉斯细胞平均密度为750个/mm。2结论:ATP酶染色法可以对猪表皮朗格汉斯细胞进行染色,并可以定量、定性观察猪表皮朗格汉斯细胞。

非侵入式射频在面部年轻化治疗的有效性和安全性

目的探讨非侵入式射频应用于面部年轻化治疗的有效性和安全性。方法解放军第153医院激光美容中心2010年7月至2015年3月美容门诊收治求美者198例,其中男42例,女156例,年龄30~61岁,按Fitzpatrick皮肤分型为Ⅲ~Ⅳ型;应用非侵入式射频除皱术进行治疗,输出功率为单极90~110 W,双极40~45 W,眼周40~50 W,6次为1个疗程,每次治疗间隔10 d。结果 198例面部皮肤老化者应用非侵入式射频除皱术后,其总有效率大于90%,6个月有效维持率大于70%。不良反应仅有轻微的红斑和水肿,所有患者均无炎症后色素沉着、表皮灼伤及瘢痕形成等并发症。结论非侵入式射频应用于面部年轻化治疗安全、有效,而且不良反应少。

野战医疗方舱在地震灾害危重伤病员救治中的作用

目的:探讨我军第二代野战医疗方舱系统的急救方舱在地震灾害危重伤病员救治中的作用。方法:通过对地震灾害46例急危重伤病员的救治,分析抢救成功率与急救方舱设备、人力资源配置及心理干预的关系。结果:野战医疗急救方舱共收治急危重伤病员46例,抢救成功率100%。结论:现代化的急救设备,合理的人员配置和适当的心理干预,是野战医疗急救方舱伤病员抢救成功率高的重要保障。

Er:YAG像素激光在面部皮肤年轻化中的应用

目的评估铒:钇铝石榴石(Er:YAG)像素激光在面部年轻化中应用的效果和安全性。方法 2010年7月至2015年6月解放军第153医院收治颜面部色素性病变及皱纹明显的患者559例,其中男39例,女520例,年龄32~58岁,采用以色列飞顿激光公司Pixel Er:YAG像素激光治疗2个疗程。末次治疗后1个月,按照色素病损消失面积、面部皱纹消失程度评定疗效,同时观察有无色素沉着、色素减退等并发症。结果 559例患者中,轻度改善103例(18.4%),中度改善378例(67.6%),显著改善78例(14%),总有效率为100%,满意率为81.6%,无色素沉着、色素减退、增生性瘢痕等并发症发生。6个月有效维持率为67%。结论Er:YAG像素激光治疗对面部年轻化是一种安全、有效的方法。

小型香猪复方壳多糖组织工程皮肤的构建及组织学特点

目的评价制备的小型香猪复方壳多糖组织工程皮肤在组织学方面的特性,为其修复皮肤缺损创面提供实验依据。方法采用传代培养的角质形成细胞和成纤维细胞作为种子细胞,I型胶原作为真皮基质。采用气—液界面方式进行培养,通过苏木精—伊红(HE)染色、比较小型香猪的体外构建组织工程皮肤与正常皮肤的组织学特征,包括表皮、真皮结构。结果制备的复方壳多糖组织工程皮肤表皮细胞增殖活跃,分层分化良好,厚约150μm,真皮层细胞生长正常,排列有序,与机体皮肤结构相似。结论复方壳多糖组织工程皮肤组织结构良好,符合新型皮肤替代物在治疗皮肤缺损时的组织学要求。

人皮肤成纤维细胞库的构建

目的建立成纤维细胞系及细胞库。方法采用体外细胞培养技术进行皮肤成纤维细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定。结果人皮肤成纤维细胞传代至23代以上,此时的细胞数是原代培养的细胞数的数十万倍,经冻存、复苏后,人皮肤成纤维细胞仍具有增殖能力,生长状态与原代培养的人皮肤成纤维细胞相类似。结论酶消化法是培养人皮肤成纤维细胞简便、快捷的方法。

组织工程皮肤替代物构建的实验研究

目的探索组织工程皮肤替代物的构建方法。方法采用传代培养的角质形成细胞和成纤维细胞作为种子细胞,I型胶原作为真皮基质,采用气—液界面方式进行培养,用HE染色观察培养物的结构。结果培养的组织工程皮肤替代物具有正常皮肤的形态结构,具有结构致密的真皮和分化良好的表皮。结论本方法可用于活性皮肤替代物的制备。

无汗性外胚叶发育不良1例

患者男,23岁,因怕热无汗,全身毛发稀疏,牙齿发育不全23年就诊。皮肤科情况头发稀疏、细、短而干燥,眉毛稀少,外2/3缺如。睫毛正常,胡须、阴毛、腋毛及四肢毳毛缺如。额轮突出,颧骨高且宽而下半脸狭小。鼻尖小且上翘,鼻孔则大而显著。颊部毛细血管扩张,且有小丘疹如皮脂腺瘤。嘴唇厚,上唇尤为突出。牙齿部分缺失。仅有4颗犬齿,呈锥状尖牙,牙龈萎缩。组织病理表皮薄而扁平。诊断为无汗性外胚叶发育不良。