丰度加权法分析冬虫夏草RAPD多态性高度差异及动态变化

目的：检测在冬虫夏草僵虫体、子座和子囊果部位多菌共存和差异表达导致的随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）分子标记多态性及其在冬虫夏草成熟过程中的动态变化.方法：采用模糊、整体性RAPD分子标记多态性研究法,选用20条随机引物,应用ZUNIX丰度加权相似度公式和丰度加权聚类法,比对冬虫夏草3个成熟期僵虫体、子座和子囊果部位RAPD分子标记多态性,以及与中国被毛孢的差异.结果：丰度非加权算法忽略了RAPD共有扩增子的丰度差异,而丰度加权ZUNIX相似度算法和聚类法,将扩增子的丰度差异及其在冬虫夏草成熟过程中的动态变化所蕴含的全部菌物分子信息汇入分析,准确获取样本间相似度和构建聚类图.冬虫夏草全部样本的总相似度为0.42,小于总相异度0.58.3个成熟期子座样本的相似度为0.57,僵虫体为0.50.同株冬虫夏草的子座和僵虫体样本的相似度随着成熟过程出现低→高→低的变化.子囊果部位与成熟子座的相似度最高（0.87）,汇入一个聚类分枝;未成熟子座和僵虫体聚为另一分枝;这两个分枝聚为一群.而成熟中子座和僵虫体聚为一个分枝,与成熟僵虫体聚为另一群.中国被毛孢与冬虫夏草样本的相似度为0.55～0.69,与冬虫夏草聚类群之间被外群对照蛹虫草拟青霉分隔.结论：冬虫夏草各部位的RAPD分子标记多态性丰富,随着冬虫夏草的成熟而变化;冬虫夏草与中国被毛孢的RAPD多态性存在巨大差异,支持冬虫夏草是多菌和多种突变基因型菌共生的统一微生态系统的学说,不支持“冬虫夏草是一种真菌”和“中国被毛孢是冬虫夏草的无性世代”的学说.

蝙蝠蛾幼虫肠道真菌复合体中的多菌种与中国被毛孢分生孢子联合侵染蝙蝠蛾幼虫提高侵染效能

摘要：应用真菌特异性引物PCR测序、克隆测序和SNP质谱基因分型法，鉴定2株蝙蝠蛾幼虫活体肠道的真菌分离株（CHl和CH2）中的多种菌物。应用这2株分离株与中国被毛孢分生孢子联合侵染蝙蝠蛾幼虫，观察其协同侵染活性。结果表明这2株分离株呈现中国被毛孢的体外培养生长和显微形态特征。通用引物ITS4／5和蝙蝠蛾拟青霉特异性引物Pp4／5扩增子测序检出蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢ITS序列。扩增子克隆一测序和SNP基因分型法证实多种转换和颠换点突变基因型在2株分离株中共存。反复固体、液体培养证实蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢ITS序列共存，并非真菌间DNA片段漂移。应用子囊孢子或中国被毛孢侵染4～5龄蝙蝠蛾幼虫，幼虫染菌率为1．37％～3．52％，幼虫变僵时间为35～50d。应用2株分离株与中国被毛孢分生孢子联合侵染，幼虫变僵时间为5—8d，染菌率达55．2％（P〈0．001），侵染效能提高15～39倍。蝙蝠蛾拟青霉和多种点突变基因型冬虫夏草菌（包括中国被毛孢）在蝙蝠蛾幼虫肠道以天然真菌复合体形式共存；多种菌物组成的侵染源联合侵染蝙蝠蛾幼虫大幅度提高侵染效能，呈现多菌协同侵染的共生关系。