HIV-1耐药突变的研究进展

至2015年止,全球约有1 700万HIV/AIDS病例得到抗逆转录病毒治疗,使HIV-1死亡率和发病率迅速下降。随着抗逆转录病毒治疗向所有感染HIV者全面推进,HIV耐药突变问题对长期治疗也构成了威胁,并对全球2030年消除艾滋病这一重要公共卫生战略产生了负面影响。本综述试图从不同的经济和地理环境出发,从个体和群体水平上阐述了常用的抗逆转录病毒药物的遗传屏障、交互耐药程度、耐药突变的流行病学和耐药管理;同时本文汇总了高、中低两类国家的可传播性耐药(TDR)和获得性耐药(ADR)的流行方式,分析了两类具有重要的公共卫生意义HIV耐药突变问题,即治疗前耐药和暴露前预防性服药的耐药。此外,鉴于有效地对不同类国家的HIV病例的治疗和管理,分别分析了基因型耐药性检测和治疗实践方面的关联,这些内容对我国的艾滋病防治也具有一定的参考作用。

福建省MSM哨点监测HIV新近感染影响因素及分子流行特征研究

目的了解福建省MSM人群HIV新近感染状况,探讨其分子流行特征和相关影响因素,为制定艾滋病防治策略提供科学依据。方法对福建省2019年MSM哨点监测人群HIV抗体阳性样本采用HIV-1限制性抗原亲和力酶联免疫法(简称LAg-Avidity EIA)进行新近感染检测,用多因素Logistic回归分析其影响因素,通过RT-PCR扩增pol和gag区,利用系统进化树和HIV db Program软件对序列进行基因亚型和耐药突变分析。结果福建省2019年哨点监测MSM人群863人,其中总的HIV抗体阳性率为12.17%(105/863),HIV新近感染率为11.97%;Logistic回归分析显示,样本来源和最近6个月内同性肛交安全套使用频率是新近感染的影响因素;基因亚型以CRF07_BC(47.61%)和CRF01_AE(38.10%)为主,其次为CRF55-01B(9.52%)、B亚型(4.76%);HIV-1耐药率为6.67%(1/15),其中15例对蛋白酶类抑制剂、核苷类逆转录抑制剂均敏感;1例对非核苷类逆转录酶抑制剂efavirenz(EFV)和nevirapine(NVP)产生高度耐药,1例为潜在耐药。结论福建省2019年哨点监测MSM人群HIV新近感染率处于较高水平,多种亚型并存,发现原发耐药株传播,应加强对HIV新近感染者的分子流行特征变化趋势以及原发耐药传播的动态监测,及时调整防控策略,有效控制福建省艾滋病感染与传播。

汉坦病毒基因分型方法的建立及其核苷酸序列特征分析

目的使用RTnestedPCR分型检测方法及核苷酸序列测定技术,对来源于福建省内HFRS监测点的鼠肺标本及病人血清进行基因分型并对部分标本的核苷酸序列进行分析比较。结果24份阳性鼠肺标本中检出率为95.8%;20份病人血清标本中仅11份扩增阳性,检出率分别为:83%(≤1周),12.5%(>1周)。扩增阳性标本中仅1份RTPCR分型为HTN型,其余均为SEO型,这与核苷酸序列分型结果相一致。结论近年福建省流行的汉坦病毒仍以SEO型为主。核酸序列比较分析发现,福建省内同一地区流行的SEO型汉坦病毒核苷酸的同源性很高,大于99%,而不同地区病毒间核酸序列变异比较大,尤其是永春和松溪这两个地区的毒株差异达到20%左右,可能是SEO型中两个新的亚型。

汉坦病毒A_(537)核蛋白基因的分段表达及其产物抗原活性的研究

目的构建汉坦病毒S基因不同截短片段的重组表达质粒,并选择表达高活性的重组抗原应用于血清学诊断。方法从HTN型A537株基因组中扩增出S全长基因,构建TA-A537S克隆;以此为模板扩增出不同长度的截短的S片段,定向插入表达载体pET-30a,获得含不同片段的重组表达载体(pET-1-112,pET-1-119,pET-1-137,pET-1-200,pET-1-292,pET-1-316,pET-1-429,pET-6-119,pET-6-137,pET-6-200,pET-6-292,pET-6-405,pET-16-112,pET-16-137,pET-26-137),并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别进行了表达;应用SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况,应用Western blot分析重组抗原的活性,采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白,用间接ELISA法对重组蛋白的抗原性及抗原特异性进行检测。结果成功构建了含HV S全基因的TA-A537S克隆质粒;以截短的S基因片段构建的重组表达质粒中,既有表达又有活性的有pET-1-112,pET-1-119,pET-1-200,pET-1-292,pET-1-429,pET-6-119,pET-6-200,pET-6-292,pET-6-405;其中pET-6-119表达量最高且活性强;经电洗脱或Ni-NTA亲和层析可获得高纯度的重组蛋白e6-119;纯化的e6-119重组蛋白应用于ELISA检测疑似HFRS和不明原因的发热病人血清IgG,与IFAT比较,其敏感性和特异性分别为94.7%,95.6%。结论pET-6-119表达量高,易于纯化,并且具有良好的抗原性,是一种廉价、安全、可靠的诊断抗原。

双抗原夹心法ELISA在肾综合征出血热诊断中的应用

目的建立一种敏感、特异的检测肾综合征出血热(HFRS)血清总抗体的双抗原夹心法ELISA。方法应用重组汉坦病毒(HV)NP抗原e1.3S作为包被抗原和e6-119-HRP作为酶标抗原建立双抗原夹心法ELISA,检测血清总抗体,并与间接免疫荧光法(IFA)相比较。结果共检测188份人血清和378份鼠血清标本,2种方法的总符合率为97.70%。以IFA为参照标准,双抗原夹心法ELISA的敏感性为97.54%,特异性为97.87%。结论双抗原夹心法ELISA检测HFRS血清总抗体具有很高的敏感性和特异性,适用于大规模的流行病学调查。

基于In-fusion技术的高通量HIV表型耐药检测系统的建立及应用研究

目的构建基于In-fusion技术的高通量新型HIV表型耐药检测系统,用于临床表型耐药检测。方法扩增LacZ基因,插入并替换原骨架质粒pLWJ-SV40-Luc中耐药检测片段构建新的骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ,利用In-fusion定向克隆技术,将耐药检测片段插入到改造后的骨架质粒中构建耐药检测载体(RTV),并与膜蛋白表达质粒VSV-G共转染293T细胞产生HIV假病毒,在药物干预下,通过检测感染细胞中Luc+表达量来反应其对药物的敏感性。结果成功引入蓝白斑筛选改造出新的骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ。36例临床检测样本成功扩增出30例,利用In-fusion无缝连接技术成功构建26例RTV,其中21株产生的假病毒具有活性。药物敏感性实验结果显示所得的假病毒表型耐药检测结果与基因型耐药解释结果完全一致。结论成功构建出基于In-fusion技术的高通量新型HIV表型耐药检测系统,可应用于临床耐药检测,以指导临床抗病毒治疗。

应用B超研究儿童甲状腺体积

综述近几年来应用 B超诊断儿童甲状腺肿的方法及测量值研究进展。用 B超测量甲状腺体积是一种精确、客观、且安全、无创伤性的方法。目前 ,我国 8～ 10岁碘充足儿童甲状腺体积正常值均低于 WHO/ICCIDD推荐的正常值。因此 ,WHO/ICCIDD推荐的儿童甲状腺体积正常值对中国儿童并不适用 ,有必要重新建立按年龄和体表面积分组的碘充足的中国儿童甲状腺体积正常值。

间接免疫荧光试验在HIV抗体检测中的应用

[目的 ]评价间接免疫荧光试验 (IFA)作为一种确认实验在 HIV抗体检测中的应用。 [方法 ]用 T嗜性的HIV毒株感染 MT4细胞制备抗原片 ,并与不同稀释度的免疫血清相结合 ,再滴加荧光素标记的羊抗人 Ig G,在荧光显微镜下检测特异性免疫荧光。 [结果 ]用 IFA检测 43份血清样本 (其中包括 17份 WB阳性血清 ,14份阴性血清和 12份EL ISA阳性或 WB出现可疑条带但按标准不能判为阳性的可疑血清 ) ,除 HIV- 2血清呈阴性反应外 ,其余检测结果与WB相符。 IFA对 HIV- 1抗体检测的敏感性和特异性均达到 10 0 %。 HIV- 1阳性血清抗体最高滴度达到 1∶ 10 2 40。 [结论 ]IFA可用于 HIV- 1抗体检测的确认 ,它可作为 Western Blot的一种补充或替代实验。

多引物嵌套式聚合酶链反应在艾滋病病毒感染诊断中的应用

目的 评价多引物嵌套式聚合酶链反应(Nested-PCR)在艾滋病病毒(HIV)感染诊断中的应用。方法 采用柱离心式小量组织/细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)抽提试剂盒提取DNA。用3套分别来自于长末湍重复序列(LTR)-gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。结果 用多引物嵌套式PCR对28例不同来源标本进行检测,其中13例为HIV感染者,4例为HIV可疑感染者,4例为人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)感染者且HIV抗体检测为阴性,7例为正常者。经过检测每一套引物均漏检了1份标本,即每一套引物敏感性均为92.3％。HTLV标本经检测均为HIV阴性。根据判断标准,该检测方法敏感性和特异性均达到100％,最低检测线达到103外周血单核细胞(PBMC)。结论 多引物嵌套式PCR具有高敏感性及特异性,在鉴定HTV感染方面有重要的意义.可作为蛋白印迹试验的补充和辅助诊断。

福建省分离的HIV-1 Thai-B亚型感染性克隆的构建及序列分析

中国自1985年出现第一例艾滋病病人以来[1],20多年来艾滋病流行经历了传入期、播散期和快速增长期三个阶段,全国31个省、市、自治区均有病例报告。截至2009年底,

逆转录—聚合酶链反应在HIV-1感染诊断中的应用

[目的 ]评价逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)在HIV 1感染诊断中的应用。[方法 ]采用RNA一步法试剂盒提取RNA。用 3套分别来自于LTR gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。[结果 ]对 2 4例血清标本进行检测 ,其中 15例为HIV感染者 ;1例为免疫印迹试验可疑待确定 ,但经过 1年的随访可排除 ;另外 8例为正常者。经过巢式扩增 ,15份阳性标本中有 14份扩增出两条或两条以上核酸片段 ,1份未扩增出任何一条片段 ,其敏感性达93 3 % ( 14 /15 )。其中 6份肝素抗凝标本env区域均未扩增出片段。阴性标本无片段 ,其特异性为 10 0 % ( 8/8)。[结论 ]RT PCR具有高敏感性和特异性 ,可用于窗口期HIV感染的诊断及HIV 1阳性母亲所生婴儿的HIV检测 ,可作为免疫印迹试验的补充和辅助诊断。

艾滋病治疗的研究进展

艾滋病抗病毒治疗(ART),现已取得很大成效。该病原为致死性疾病,现已成为一种可治可管理的传染病,全球艾滋病病毒感染者/艾滋病(HIV/AIDS)的病例虽仍多达3 800万,但有一半以上已经抗病毒治疗。除了药物治疗外,目前一些新技术新方法如基因组编辑等也已介入艾滋病的治疗,并且在人源化动物试验中业已取得很好的效果。不容置疑,艾滋病终究会被人类控制消除。但随着艾滋病抗病毒治疗的不断发展,最根本的问题也就是HIV潜伏库的问题日益突出,不论是分子治疗、组合治疗都存在这样的问题。因此,不断寻找新的潜伏病毒细胞的标记,缩小病毒潜伏库,是当前艾滋病治疗必须解决的课题。此外,尽管艾滋病的防治取得了很大成绩,但目前全球每天仍有近6 000例HIV/AIDS感染的病例发生。因此,安全有效疫苗的研发,不论在预防领域、还是在临床治疗方面,都有其积极的意义。

福建省艾滋病患者抗病毒疗效和耐药性检测分析

目的了解我省艾滋病患者的抗病毒疗效与基因耐药性突变发生情况,为抗病毒治疗提供依据。方法采集我省25例接受抗病毒治疗的艾滋病患者外周静脉抗凝全血进行CD4+T淋巴细胞计数,分离血浆进行HIV病毒载量检测,并提取血浆标本中HIVRNA,用RT-PCR方法扩增HIVpol区蛋白酶基因全序列与部分逆转录酶序列。所得扩增片段进行序列测定后,数据运用ContigExpress编辑校正后上传至斯坦福大学HIV耐药数据库进行比对,同时运用Bio-Edit、Clustal和Mega等软件进行系统发生分析。结果本研究中的17例(68%)患者的病毒载量在1000cp/ml以下,其中40%(10例)降至检测限之下。RT-PCR获得10例患者的扩增片段。对其序列亚型测试结果表明:7例属于HIV-1AE亚型,2例HIV-1B亚型,1例为HIV-1D亚型;耐药性分析表明:10份序列对PI(蛋白酶抑制剂)药物均表现为敏感,8份序列对NRTI(核苷类逆转录酶抑制剂)及NNRTI(非核苷类逆转录酶抑制剂)表现出至少对3种药物高度耐药,最常见的突变位点为G190A、K103N和M184V,造成对NVP、3TC的高度耐药。结论目前我省艾滋病患者的抗病毒治疗取得预期效果。随着治疗时间延长,患者免疫功能也逐渐恢复,但耐药性突变发生种类和数量有所增加,出现对现有各类一线药物不同程度的耐药。为保证可持续性治疗策略的施行,需加强对抗病毒治疗患者的依从性教育,同时加强耐药性监测,及时评估治疗失败者耐药性情况,必要时提供二线药品,减少我省HIV病毒耐药株的产生与传播,保障抗病毒治疗的有效进行。

福建省鼠间肾综合征出血热流行病学调查

目的掌握福建省鼠间肾综合征出血热(HFRS)流行情况和疫源地分布,为控制HFRS的流行提供参考。方法根据福建省啮齿动物地理区划以及肾综合征出血热病例分布状况,选择18个县、市作为调查地区,用笼夜法捕鼠采集血清标本,用双抗原夹心ELISA法检测血清中抗汉坦病毒(Hantan virus,HV)抗体,分析鼠间HFRS流行情况。结果各个地区HV宿主动物种类分布不均衡,但以褐家鼠为主要宿主动物,其次为黄胸鼠,野外鼠密度较低。褐家鼠抗体阳性率最高,达到9.89%。各个地理区划中II区即闽东山地抗体阳性率最高,为9.32%,而III区即闽中、闽西南山地抗体阳性率最低,为2.74%。调查点中泰宁、周宁、福鼎、厦门、福清、莆田、平潭等地鼠血清HV抗体阳性率均超过10%。而上杭、漳平、漳浦、安溪等地鼠血清均未检出HV抗体。结论福建省HFRS的疫源地以家鼠型疫区为主,降低家鼠尤其是褐家鼠密度,可控制本病在福建的扩大流行。

2008-2013年福建省HIV-1毒株耐药基因变异研究

目的分析2008-2013年福建HIV-1毒株耐药基因变异情况。方法收集2008-2013年福建省病毒载量大于1 000copy/mL艾滋病患者,采用自建HIV-1基因型耐药检测进行耐药检测和分析。结果共收集226例病毒载量大于1 000copy/mL样本,平均载量值1.62×105copy/mL;124例样本扩增及测序后获得蛋白酶以及部分反转录酶基因序列,亚型分析显示92例(74.2%)为CRF_01AE亚型,14例(11.3%)为B亚型,C和BC亚型各有7例,另4例为其他亚型。77对反转录酶以及蛋白酶抑制剂有不同程度耐药;对核苷类和非核苷类反转录酶抑制剂的耐药分别有63例(50.8%)和74例(59.7%),对蛋白酶抑制剂耐药9例(7.3%);核苷类反转录酶抑制剂主要耐药突变包括了M184V、M41L、D67N、L70R、T219F、K219Q等,造成对3TC、AZT、D4T等不同程度耐药;非核苷类反转录酶抑制主要耐药突变包括K101E、Y181C、K103N、G190A等,造成对NVP和EFV不同程度耐药。结论福建省HIV-1感染者总体耐药率较低,但是随着治疗人数增加以及治疗时间延长,对反转录酶抑制剂出现较高程度耐药,仍需加强艾滋病患者耐药检测。

福建省MSM人群中HIV-1感染者原发性耐药基因突变研究

目的研究我省男男性行为者(MSM)中未经抗病毒治疗的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的原发性基因耐药性突变发生情况,为该人群的抗病毒治疗药物选择提供依据。方法采集福建省尚未接受抗病毒治疗的MSM HIV-1感染者的外周静脉抗凝全血,分离血浆,提取血浆中HIV RNA,用RT-PCR方法扩增HIV pol区蛋白酶基因全序列与部分逆转录酶序列。所得扩增片段进行序列测定后,数据运用Contig Express拼接编辑校正后上传至斯坦福大学HIV耐药数据库进行比对,同时运用Bio-Edit和Mega等软件进行系统发生分析。结果获得50份HIV-1分离株完整的PR和RT基因序列,其中60%(30/50)为01_AE重组亚型,18%(9/50)为B亚型,20%(10/50)为07_BC重组亚型,1例08_BC重组亚型。耐药分析显示,1例发生PI(蛋白酶抑制剂)药物的主要耐药突变M46I,造成对NFV中度耐药。10例样本出现NNRTIs和NRTIS的耐药相关突变,仅1例解释为对NNRTIs的潜在低水平耐药,由V179E引起。结论福建省MSM HIV-1感染者的原发性耐药突变发生率低,有利于今后该人群抗病毒治疗工作的开展,但需加强监控该人群耐药毒株的传播。

福建省艾滋病抗病毒治疗患者生存时间影响因素分析

目的了解福建省艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)患者接受抗病毒治疗后生存时间的影响因素,为进一步改善患者的生存状况,提高抗病毒治疗工作质量提供参考依据。方法利用国家统一的中国疾病预防控制系统艾滋病综合防治信息系统中福建省治疗数据信息,使用SPSS 15.0进行相关分析。通过筛选,本次研究共纳入1 061例患者,死于AIDS相关疾病66例(6.22%)。结果 Cox比例风险模型分析结果表明,基线CD4+T淋巴细胞计数<200、基线时患者有持续或间断发热影响患者抗病毒治疗后生存时间。结论结合抗病毒治疗生存时间影响因素分析,在疾病早期符合抗病毒治疗标准时尽早开始治疗对患者生存预后有益。

福建省未经抗病毒治疗的HIV-1毒株耐药基因变异研究

目的研究福建省未经抗逆转录病毒治疗的艾滋病病毒感染者/艾滋病患者(HIV/AIDS患者)HIV的逆转录酶和蛋白酶耐药基因变异情况,为福建省开展HIV-1抗病毒治疗提供本底资料。方法采集福建省未经抗病毒治疗的HIV/AIDS病例的抗凝全血,分离血浆,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HIV-1pol区序列并直接进行序列测定,提交Web站点http://hivdb.stanford.edu进行耐药突变分析。结果选取74份流行病学资料及序列资料完整的样本进入耐药基因分析,结果显示,蛋白酶基因的次要耐药突变广泛存在,以M36I、L63PI、93L等多态性突变类型为主,未发现与蛋白酶抑制剂耐药相关的突变。逆转录酶区的耐药突变分布较为分散,发生率为20.27%(15.74)。依据耐药性解释,发现3例样本(4.05%)表现为对部分逆转录酶抑制剂的潜在或低度耐药。结论福建省未用药的HIV感染者中,耐药相关突变尚处于低流行状态,在开展抗病毒治疗后应当定期进行耐药性检测以期获得较好的效果。