瘤背石磺Egr-1基因的克隆、分析及低频声音刺激对其表达的影响

早期生长反应因子1(Egr-1)基因又名为Zif268、NGFI-A、Krox-24、Tis8、ZENK,分布于脊椎动物的神经细胞中,参与识别功能相关的神经活动。本研究通过c DNA末端快速扩增法(RACE)获得瘤背石磺(Onchidium reevesii)Egr-1基因全长序列,进行蛋白质特征分析、氨基酸序列预测以及Egr-1基因的组织差异表达,并检测了不同低频声音(0~200 Hz)刺激0~24 h后Egr-1基因表达量的变化。结果显示:瘤背石磺Egr-1基因c DNA序列全长2556 bp,含134 bp的5’端非编码区、709 bp的3’端非编码区和1713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸。瘤背石磺Egr-1蛋白分子质量为61.31 kD,理论等电点为6.14,平均疏水指数-0.491,不含信号肽;二级结构和三级结构预测显示有琢螺旋和茁折叠。瘤背石磺Egr-1基因在其腹足、背部皮肤、神经节、肝胰腺、两性腺中均有表达,在神经节和两性腺中高表达,背部皮肤和肝胰腺中组织表达量最低(P<0.05)。相比对照组,受到低频声音刺激0.5 h,后瘤背石磺神经节中Egr-1基因的表达量显著升高,且不同频率声音间表达量差异显著(P<0.05),推测Egr-1基因参与了瘤背石磺识别低频声音功能相关的神经活动,所得结果为进一步研究瘤背石磺识别处理声音信息的分子机制提供重要的基础数据。

瘤背石磺磷脂酶C基因的克隆及在不同声波刺激下的表达

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)是一类与膜蛋白相关的酶,在信号转导途径中起作用。栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)能够感知当地的潮汐规律,为了探究瘤背石磺中磷脂酶C在潮汐感知中的作用和分子机制,本实验以瘤背石磺神经环为实验材料,利用RACE-PCR技术得到了其cDNA全长,并进行生物信息学分析和实时荧光定量PCR实验。结果显示,瘤背石磺PLC基因的cDNA全长为2 578 bp,开放阅读框1 881 bp, 5′非编码区337 bp, 3′非编码区340 bp,并且在末端存在AATAAA加尾信号,共编码627个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,瘤背石磺PLC氨基酸序列与福寿螺的磷脂酶C样蛋白2氨基酸序列匹配度最高,与传统形态学的分类相吻合。在实验室内模拟潮汐产生的音波来刺激瘤背石磺,使用实时荧光定量PCR检测OrPLC基因在瘤背石磺神经环中的表达,结果显示:OrPLC在刺激声波频率为40 Hz和70 Hz的时候表达量基本稳定;声波频率为160 Hz和310 Hz时表达量较低;在声波频率为220 Hz和280 Hz时,处于高表达的状态,说明该基因在瘤背石磺的低频感知中发挥重要作用。该实验为进一步了解瘤背石磺潮汐感知功能研究奠定了理论支撑。