LAMB3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定

目的 构建含有LAMB3基因的慢病毒表达载体,并感染HaCaT细胞,评价重组慢病毒载体提高LAMB3基因及蛋白表达的效果。方法 提取皮肤组织的总RNA,通过反转录方法扩增LAMB3基因,将其连入慢病毒载体pCDH-CMV中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行LAMB3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,浓缩纯化病毒液,感染HaCaT细胞并提取细胞的总蛋白和总RNA,用qPCR方法检测LAMB3 mRNA在感染病毒的HaCaT细胞中的表达,通过Western blot方法检测LAMB3蛋白在感染病毒的HaCaT细胞中的表达。结果 构建的慢病毒载体pCDH-CMV-LAMB3经测序分析证实基因序列正确。包装后的慢病毒滴度为108PFU/mL。qPCR方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3过表达组与空白对照组相比,LAMB3蛋白表达量显著增加,LAMB3蛋白在翻译水平有表达。结论 本研究构建的携带LAMB3基因的重组慢病毒能够感染HaCaT细胞,并使其LAMB3基因及蛋白含量增加。

纳晶微针导入5%米诺地尔联合复方甘草酸苷对斑秃患者血管内皮细胞生长因子及毛囊中相关分子表达的影响

目的探讨采取纳晶微针导入5%米诺地尔+复方甘草酸苷治疗斑秃的效果及对血管内皮细胞生长因子(VEGF)、毛囊相关分子表达的影响。方法选取122例斑秃患者随机分成实验组62例与对照组60例,两组均采取5%米诺地尔联合复方甘草酸苷治疗,复方甘草酸苷均采取口服用药方式,在5%米诺地尔给药上对照组采取局部外用方法,实验组采取纳晶微针导入方法,比较两组经3个疗程的治疗效果。结果实验组有效率95.16%高于对照组80.00%(P<0.05);治疗后血清TNF-α较治疗前降低,VEGF较治疗前提高,实验组指标变化幅度较对照组显著(P<0.05);治疗后血清IL-4、IL-10较治疗前提高,实验组高于对照组(P<0.05);毛囊Fas、FasL表达水平均治疗前降低,且实验组低于于对照组(P<0.05);两组治疗期间不良反应总发生率无显著差异(P>0.05)。结论在斑秃治疗上,采取纳晶微针导入5%米诺地尔联合复方甘草酸苷的治疗方法,可取得满意效果,改善血清炎症因子水平,升高VEGF表达及降低毛囊相关分子表达水平,值得推广。

IL-17a通过STAT3信号通路调节HaCaT细胞中IL-6、IL-22、IL-23的表达

目的:探讨IL-17a刺激人角质形成(HaCaT)细胞对分泌白介素-6(IL-6)、白介素-22(IL-22)、白介素-23(IL-23)的影响以及IL-17a调控角质形成细胞中IL-6、IL-22、IL-23表达的可能机制。方法:将HaCaT细胞随机分为空白对照组(DMEM高糖培养基)、IL-17a诱导组(含80μg/L IL-17a的DMEM高糖培养基)、抑制剂组(含80μg/L IL-17a的DMEM高糖培养基和10μmol/L STAT3抑制剂白皮衫醇),48 h后用ELISA法检测各组上清液的IL-6、IL-22、IL-23浓度,实时荧光免疫定量-聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测各组HaCaT细胞中IL-6、IL-22、IL-23 mRNA表达水平,同时用Western Blot检测STAT3的表达水平。结果:与空白对照组和抑制剂组比较,诱导组的HaCaT细胞IL-6、IL-22、IL-23表达水平及mRNA均明显升高(P<0.05);与空白对照组和抑制剂组比较,诱导组的HaCaT细胞STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:IL-17a可促进HaCaT细胞分泌IL-6、IL-22、IL-23,其调控机制可能通过STAT3来实现。

FASAY技术在肝癌p53基因功能突变检测中的应用

酵母中分离的等位基因功能分析技术(functional analysis of separated alleles in yeast,FASAY)是一种检测基因结构与功能关系的有效方法.利用FASAY技术结合DNA测序对28例临床原发性肝细胞癌手术样本中的p53基因结构突变与P53蛋白的功能进行了检测.结果发现在这些肝癌组织样本中,FASAY检测的阳性结果为15例,p53基因突变率为53.6%.cDNA测序的结果表明15例FASAY阳性样本均发生了p53基因突变,而13例FASAY阴性样本中未检测到基因突变.在15例p53基因突变肝癌样本中,有8例249位密码子突变,其中包括一例首次报道的249Thr双点突变(GC746.GC747→CG746.TA747),其余均为249Ser突变.研究结果表明,FASAY是一种灵敏的检测HCC中的p53基因结构与功能突变的技术,它可推广应用于肝癌临床样本的研究.

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中hNTKL-BP1基因的表达

分别提取手术切除人原发性HCC肝癌和癌旁肝组织总RNA并逆转录为cDNA,在hNTKL-BP1基因的高保守区设计相应引物和Taqman荧光探针,实时检测PCR产物的荧光强度,采用2-△△Ct方法分析比较该基因在人类肝癌组织和癌旁肝组织中的表达差异.结果是44例原发性HCC肝癌组织中hNTKL-BP1基因表达水平显著高于癌旁肝组织(t=2.69,P<0.01),肝癌组织与癌旁肝组织hNTKL-BP1基因表达差异和肿瘤大小有一定的相关性(P=0.028),hNTKL-BP1基因可能与肝癌的发生、发展有一定相关性.