猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

设计了一对特异性引物,对16头临床症状、病理变化和ELISA检测呈阳性的猪繁殖与呼吸障碍综合征疑似病例的肺脏、脾脏和淋巴结以及种公猪的精液进行了RT-PCR扩增。结果显示16头样品的相应组织及精液都扩增出特异性基因片段,阳性符合率为100%,8头猪繁殖与呼吸障碍综合征血清ELISA检测为阴性的对照样品中有2头扩增出阳性片段,检出率为25%。RT-PCR检测方法的建立为猪繁殖与呼吸障碍综合征的准确诊断提供了技术手段。

添加外源核苷酸和氨基酸对雏鸡生产性能的影响

以密码子使用频率为指导进行日粮氨基酸生物配比。在增加外源核苷酸的条件下 ,雏鸡的日增重明显增加。 34日龄对照组与实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的日增重分别为 (9.5 2± 0 .4 94 )、(10 .4 9± 0 .2 0 4 )、(10 .2 1± 0 .5 4 7)、(11.4 1± 0 .716 )和 (11.2 1± 0 .2 31) g。肝脏中总RNA含量分别为 (3996 .2± 16 1.5 7)、(44 39.4± 174 .96 )、(42 39.6± 91.12 )、(475 8.4±12 2 .93)、(486 4 .6± 172 .0 4 ) μg/g。结果表明 ,外源核苷酸在家禽体内能被利用 。

支气管败血波氏杆菌PRN黏附素R1区蛋白的免疫原性

百日咳杆菌黏附素(PRN)是支气管败血波氏杆菌最重要的保护性抗原。为研究PRN的R1区多肽的免疫原性,分别将prn基因的全长编码区2 040 bp及5′端1 173 bp的片段(prnR1)克隆到原核表达载体pGEX-KG,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达。SDS-PAGE和Western blot检测证实2种表达产物GST-R1和GST-PRN均具有良好的免疫学反应活性。在主动免疫保护试验中,GST-R1和GST-PRN免疫组小鼠均能产生较高的PRN抗体水平;当使用3 LD50的Bb强毒株HH0809进行鼻腔攻毒后,其保护率均为100%(9/9);当使用10 LD50HH0809攻毒时,其保护率分别为33.3%(3/9)和77.8%(7/9)。在被动免疫保护试验中,腹腔免疫GST-R1和GST-PRN兔抗血清均能100%(10/10)保护小鼠抵抗10 LD50HH0809的腹腔攻击,但经PRN吸附后的2种兔抗血清均失去了保护力(0/5)。这些研究结果表明,重组PRN的N端R1区多肽具有良好的免疫原性。

鸡IL-2基因cDNA输卵管组织特异性表达载体的构建与表达

将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。

鸡卵清蛋白基因5′端调控区的克隆及其序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出了 1.0 0kb的鸡卵清蛋白基因 5′端调控区序列。序列分析表明 ,该区域含有TATA框及激素识别位点 ,具备输卵管定位表达的调控能力。为外源基因在鸡输卵管中的定位表达奠定了基础。

鸡IFN-γ基因转录诱导方法及其cDNA克隆的研究

应用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鸡新城疫Ⅰ系疫苗(NDV-Ⅰ)诱导的鸡胚和成鸡脾脏及成鸡白细胞中提取的总RNA中扩增得到鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因cDNA,并与体外诱导培养的淋巴细胞的方法相比较。结果表明,NDV-Ⅰ以50倍或100倍稀释度接种鸡胚48h提取脾脏总RNA扩增效果以及以5倍或10倍免疫剂量免疫成鸡48～72h提取脾细胞或血液白细胞总RNA扩增效果最佳,与体外培养诱导的效果相同。

2003～2005年河南省鸡传染性法氏囊病流行病学调查

对2003～2005年间河南省15个地区鸡群传染性法氏囊病的流行情况进行了调查。发现传染性法氏囊病的发病有全年化趋势,但每年仍以6～9月份为发病高峰期;发病鸡的日龄范围扩大;病变以法氏囊呈胶胨样水肿和肾脏尿酸盐沉积为主要特征,二者出现率分别占67.2%和73.11%,其它病变多不典型;发病鸡群中免疫鸡群占78.17%;二次发病鸡群约占16.98%;宿主和易感群体的范围扩大。对出现上述情况进行了初步的分析并提出相应的措施。

禽流感母源抗体消长规律和免疫保护抗体临界值的测定

对初生雏鸡的AI母源抗体进行了动态观察 ,并在HI效价为 6 (Log2 )和 4 (Log2 )、2 (Log2 )左右时 ,分别应用禽流感病毒进行攻毒。结果显示 :初生雏鸡AI母源抗体HI效价的峰值在 7日龄时 (7.85 (Log2 ) )出现 ,比 1日龄 (6 .8(Log2 ) )时高出 1个倍比滴度 ;7日龄后HI效价即随雏鸡日龄的增加而迅速下降 ;至 2 8日龄时 ,已趋于消失。攻毒试验中 ,当HI效价为 6 (Log2 )左右时 ,其保护率为 10 0 % ;在 4 (Log2 )时 ,保护率仅为 5 0 % ;在 2 (Log2 )左右时 ,保护率只有2 0 %。由此说明 ,能使雏鸡对AIV的攻击获得完全保护的临界值应在 4 (Log2 )～ 6 (Log2 )之间 ,且必须大于 4 (Log2 )。

禽流感(H9)病毒的分离鉴定及免疫试验

从豫西某发病鸡群中分离到一株病毒,经HA、HI试验鉴定为H9型禽流感病毒,以该分离毒株作为种毒,制备了禽流感灭活油乳苗,经免疫试验和田间试验证明,该苗在接种后第14天即可产生坚强的免疫力(HI效价为9.0(log2)),至第28天血清中HI效价达到峰值9.5(log2),直到第49天,其HI效价仍为7.5(log2),此时攻毒,免疫接种组的保护率为100%(死亡率为0%),而对照组死亡率为70%,证明该苗产生免疫力快、强而且持久,能有效地控制该禽流感毒株在本地区的流行。

鸡卵清溶菌酶5′端激素受体结合位点的克隆与序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出0.35kb的鸡卵清溶菌酶5′端激素受体结合位点的基因片段。序列分析表明,该区域含有2个睾酮激素受体识别位点和2个皮质酮激素受体识别位点,具备输卵管定位表达调控增强能力,为构建融合定位表达启动子调控外源基因在鸡输卵管定位表达奠定了基础。

鸡传染性法氏囊病细胞灭活油乳苗的研制及免疫效果测定

本研究利用由地方流行毒株选择，培育的鸡胚成纤维细胞适应株作为制苗用种毒，研制成功了ＩＢＤ细胞灭活油乳苗，试验接种雏鸡后第３０ｄ，血清中ＡＧＰ阳性率达８０％，在免疫后６０ｄ时对强毒攻击的保护率为１００％，对鸡无毒副作用，室温保存１２个月不影响免疫效果。

鸡传染性法氏囊病油乳剂组织灭活苗的研制与免疫效果测定

选择自然发病鸡有典型病变之法氏囊．研制了油乳剂组织灭活苗，试验接种健康雏鸡第10、20、30、60、90和120天后，其血清AGP抗体阳性率分别为20％、50％、100％、100％、100％和70％。免疫后第60天攻击IBD强毒，保护率为100％，对鸡无毒副作用，室温保存12个月不影响免疫效果。

IBDV不同野毒株鸡胚传代过程中VP2基因变异动态的研究

对分离于河南省的YX08、YX12和YB02 3个IBDV野毒株进行了鸡胚连续传代,对各变异代数的VP2高变区基因进行了RT-PCR扩增和序列分析。结果显示,各毒株随传代次数的增加,与经典毒株Cu-1及弱毒株P2的同源性有所增高;各毒株的变异代数和变异位点不尽相同,232位、233位、234位及253位氨基酸的密码子在传代过程中是易变密码子。

IBDV地方流行株鸡胚毒三价油乳灭活苗免疫效果研究

将分离于河南省的YX08、YX12和YB02野毒株的第10代鸡胚传代毒作为种毒接种鸡胚，用收获的鸡胚绒毛膜尿囊液试制出三价油乳灭活苗，并对其进行检测和免疫效果比较。结果表明：三价油乳灭活苗和三价油乳灭活苗与活疫苗联合免疫效果均明显优于活疫苗免疫组，平均AGP效价分别达到2^2.8和2^3.0；当活疫苗免疫组鸡血清中已无可测性抗体时，三价油乳灭活苗免疫组和联合免疫组仍具有2^1．8和2^1.2的AGP效价。在接种后第30，60天，分别用传染性法氏囊病病毒标准强毒株BC6／85、地方野毒株YX08、YX12和YB02进行攻毒试验。在接种后第30天，三价油乳灭活苗和联合免疫疫苗对这4个毒株的攻击可提供93．3％～100％的保护；单独的活疫苗可提供60．0％～80．0％的保护；在接种后第60天，三价油乳灭活苗、联合免疫疫苗和活疫苗分别能提供80．0％～93．3％、80．0％～93．3％和40．0％-53．3％的保护。

貉延髓网状结构和中缝区神经核团形态及细胞构筑的研究

应用石蜡连续切片及神经细胞染色技术，对貉延髓网状结构和中缝区神经核团的形态及细胞构筑进行了定量研究，得到了上述区域核团的形态及细胞构筑特征。

鸡IL-18真核表达载体的构建及其对新城疫疫苗免疫增强作用的研究

利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所产生的HI抗体效价和T、B淋巴细胞增殖反应均高于单纯疫苗免疫组及pcDNA3 空白质粒和疫苗联合免疫组。其中,HI抗体效价在15 d 时差异显著(P<0 05),在30 和35 d时差异极显著(P<0 01); T淋巴细胞增殖反应在15 d后均表现为差异显著(P<0 05〉或极显著(P<0 01);而单纯疫苗组与空白质粒和疫苗联合免疫组之间的各测定指标则无明显的差异(P>0 05)。在35 d时进行攻毒, pcDNA3 IL18和疫苗联合免疫组的保护率为83.3%,而单纯疫苗免疫组、空白质粒和疫苗联合免疫组鸡的保护率则分别只有61.5%和66.7%。说明该pcDNA3 IL18真核表达质粒在鸡体内得到了表达,表达产物不仅能够显著增强新城疫疫苗所诱导的细胞免疫和体液免疫反应,而且还可以明显提高疫苗的保护率。

猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。

不同时期NDV地方株F基因的克隆及序列分析与基因型研究

利用RT-PCR技术对1998-2002年闯洛阳地区新城疫典型发病禽群中所分离到的15个毒株的F基因主要功能区片段进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同，15个地方毒株可分为3群，群内各毒株同源性较高，群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同所引起的明显的株间差异。其中第1群9株，涉及到各时间段分离的毒株和所有分离禽品种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚型区；第2群4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株。分散于进化树的基因Ⅵ型区；第3群2株，属古典基因Ⅱ型的弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。结果表明，近年来该地区流行的新城疫病毒以新的基因Ⅶ型为主，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株在该地区流行的时间较短，株间差异不大。

鸡IL-18真核表达载体的构建及其对IBD灭活疫苗免疫增强作用的研究

目的 :探讨鸡IL 18的功能活性及对鸡用疫苗的免疫增强作用。方法 :将鸡IL 18编码区cDNA定向克隆至pcDNA3载体构建了鸡IL 18真核表达质粒 ,与传染性法氏囊病 (IBD)灭活疫苗联合应用 ,通过中和抗体的检测、胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA增殖反应的观察 ,研究了其对IBD胚毒灭活疫苗的免疫增强效果。结果 :同时接种IBD灭活疫苗和IL 18真核表达质粒的免疫鸡所产生的中和抗体效价在接种第 2 8天后明显高于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;其T、B淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组 ,尤其是T淋巴细胞的增殖反应从接种后第 2 1天开始即明显强于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;接种后第 4 2天时进行的攻毒试验结果表明 ,同时接种IL 18表达质粒的试验组鸡获得 93 3%的保护 ,而单纯疫苗接种组的保护率只有 86 7%。结论 :鸡IL 18真核表达质粒在鸡体内得到了良好表达 ,表达产物不但具有明显的增强IBD灭活疫苗诱导细胞免疫的作用 ;同时 ,对于中和抗体水平的提高、B淋巴细胞增殖反应的加强也具有明显的作用。科技大学禽病研究室应用IBDV地方野毒株 (L0 15和L0 17株 )所制备的胚毒灭活油乳苗。1 1 2 实验用鸡 为洛阳市新安县机械化鸡场提供的 1日龄健康罗曼雏公鸡 ,自饲养至所需日龄。1 1