人椎间盘髓核来源的诱导多能干细胞重编程及功能的研究

椎间盘退变始发于髓核组织,获得足够有功能的髓核细胞是研究及治疗椎间盘退变的关键.而人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)不仅为建立疾病模型以研究疾病发生发展机制开辟了道路,还在再生医学领域展现出了广阔的应用前景.我们首先从椎间盘退变患者微创手术获得的髓核组织内分离髓核细胞,将携带OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的仙台病毒(Sendai virus,Se V)转染髓核细胞,重编程获得iPSC.通过检测多能细胞特异性标志、体内成瘤实验、甲基化及核型分析对所获得的iPSC进行鉴定.并以皮肤成纤维细胞来源iPSC作为对照,在二维和三维水凝胶中对iPSC进行定向分化,检测髓核细胞相关蛋白和基因的表达,比较分析2种iPSC向髓核细胞的分化效率.结果显示,iPSC能表达多能细胞特异性标志,具有正常的二倍体核型,畸胎瘤实验显示三个胚层的出现.诱导分化后的iPSC表达髓核相关基因和蛋白,在水凝胶中诱导培养后,iPSC表达更多的髓核相关基因和蛋白.髓核来源的iPSC与成纤维细胞来源的iPSC相比,可表达更多的髓核相关基因和蛋白.本研究首次将患者退变髓核细胞重编程成iPSC,并在水凝胶内将其诱导分化为髓核样细胞,为椎间盘退变个体化细胞治疗奠定基础.

诱导多能干细胞对骨关节炎软骨损伤的修复作用

背景:基于干细胞的细胞治疗对于骨关节炎修复有重要的应用前景,其中诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS细胞)具有较强的增殖和分化潜能,且避免了胚胎干细胞的伦理学问题,目前被认为是细胞治疗中最有前景的种子细胞之一。目的:拟探索一种i PS细胞向软骨细胞分化的有效方法,并研究i PS细胞来源软骨细胞对骨关节炎的修复作用。方法:运用三步法将人i PS细胞诱导分化成软骨样细胞,并检测软骨细胞特异性基因和蛋白的表达。然后将分化后的i PS细胞移植到谷氨酸钠碘乙酸诱导的骨关节炎大鼠模型中。移植实验分为4组:对照组注射生理盐水,造模组注射谷氨酸钠碘乙酸,i PS细胞移植组注射谷氨酸钠碘乙酸后移植i PS细胞,分化后i PS细胞移植组注射谷氨酸钠碘乙酸后移植软骨分化后的i PS细胞。移植15周后micro-CT行断层扫描,并对移植后的关节进行组织学分析。结果与结论:(1)与未分化的i PS细胞相比,经过6 d的拟胚体形成和2周的细胞分化,软骨细胞特异性基因和蛋白(Col2A1,GAG和Sox9)的表达量都明显上升;(2)细胞移植15周后,未观察到免疫反应的发生,micro-CT显示移植细胞后软骨下骨的完整性明显得到改善,组织学分析也表明移植细胞后能产生关节软骨基质。i PS细胞来源软骨细胞的修复效果明显好于i PS细胞;(3)结果表明,i PS细胞来源软骨细胞移植可促进骨关节炎大鼠软骨再生,改善关节功能。

脂肪干细胞结合电纺生物膜制备“三明治”样心肌片层

背景:越来越多研究表明,组织工程化心肌细胞片层可为心肌梗死后的细胞修复提供一种可靠的治疗方法。目的:以壳聚糖-胶原电纺膜作为支撑膜、脂肪干细胞作为种子细胞,构建"三明治"样多细胞片层。方法:制备壳聚糖与Ⅰ型鼠尾胶原质量比分别为7∶3、5∶5的壳聚糖-胶原电纺生物膜。将第4代脂肪干细胞接种于温敏培养皿培养3 d,分别加入两种壳聚糖-胶原电纺生物膜,20℃培养15 min;待细胞片边缘卷起后,将电纺膜及细胞片层一同移至另一脂肪干细胞生长完全融合的温敏培养皿表面,有细胞层一面朝上,培养30 min后,加入心肌细胞培养基进行培养。培养2周后,多光子显微镜观察细胞状态,免疫细胞化学、Western blot及流式细胞仪检测细胞心肌组织特异性肌钙蛋白Tn I和缝隙连接蛋白Cx43的表达,实时定量PCR仪检测心肌细胞特异性基因表达。结果与结论:(1)细胞状态:7∶3壳聚糖-胶原电纺膜不能为细胞增殖提供足够的空间,5∶5壳聚糖胶原膜能为脂肪干细胞的附着和结构塑形提供更好的支持;7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组死细胞多于5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组;(2)Tn I、Cx43蛋白表达:5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组细胞Tn I、Cx43蛋白表达多于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组(P<0.05);(3)心肌细胞特异性基因表达:5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组细胞α-sk A、β-MHC、Tn I、Cx43、ANP、GATA-4和Nkx2.5 m RNA表达均高于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组;(4)结果表明:5∶5壳聚糖-胶原电纺膜作为支架有利于脂肪干细胞的增殖与分化,更适宜构建"三明治"样细胞片层。

整合KGN的壳聚糖-透明质酸水凝胶用于髓核修复的研究

可注射水凝胶在退变髓核组织再生修复中有着重要的意义。研究以磷酸甘油(glycerol phosphate, GP)作为交联剂,利用壳聚糖(chitosan,CS)和透明质酸(hyaluronicacid,HA),制备不同体积比的水凝胶(CS:GP:HA,6:3:1,5:3:2,4:3:3,3:3:4,2:3:5,1:3:6,V:V:V),并整合小分子物质kartogenin(KGN)。检测水凝胶的成胶时间,形态学特征,溶胀度,压缩模量,生物降解度,KGN累积释放量及细胞生物相容性。然后研究KGN,TGF-β及KGN+TGF-β对促进人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,ADSCs)分化为髓核样细胞的影响。结果表明含高浓度HA的水凝胶成胶时间短,溶胀度高,生物降解及KGN释放速率快;其中体积比为5:3:2(CS:GP:HA)的水凝胶更适于脂肪干细胞增殖和分化;免疫荧光及实时定量PCR显示KGN,TGF-β及KGN+TGF-β诱导Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量与对照组相比具有显著性差异,但各组间差异无统计学意义。研究成功建立可缓释KGN的可注射CS/HA/KGN水凝胶体系,该体系能促进脂肪干细胞增殖并分化为髓核样细胞,为临床椎间盘髓核退变微创手术后髓核再生修复提供一个简单有效的方法。

利用电纺生物膜进行多细胞片层制备的方法研究

目的机体损伤和病变造成的组织缺损通常可以组织工程的方式来进行修复。方法本研究结合细胞片层技术和静电纺丝技术,利用脂肪干细胞制备多细胞片层，并对各种电纺生物膜结构形貌、亲水性能、力学性能、以及与脂肪干细胞相容性等进行较为深入的比较研究。结果表明制备的仿细胞外基质（ECM）结构的多孔网状电纺生物膜在形态上模拟ECM，而且具有孔隙率高,贯通性好,比表面积高,利于细胞的生长和粘附的特点。结论本研究利用电纺生物膜作为支撑膜，增加了细胞的增殖空间和营养物质的流通，又保证了细胞片层在转移过程中的完整性，从而给临床多细胞片层移植治疗提供了一个简便易行的操作方法。