贵州省三穗县鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析

为了解贵州省三穗县鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的流行血清型、毒力和耐药情况,本试验从贵州省三穗县6个规模养鸭场临床疑似RA感染的病鸭体内分离出6株分离菌,对病原菌进行分离鉴定、毒力基因检测和耐药性分析。细菌分离鉴定结果显示,分离菌在巧克力琼脂培养基上长出表面光滑、圆形半透明的滴状菌落;革兰氏染色呈阴性短小杆菌,瑞氏染色呈两极浓染;分离菌均不具运动性,尿素、触酶和氧化酶试验均为阳性,符合RA生化特性,将6株分离菌分别命名为SS-RA1~SS-RA6;6株分离菌的16S rRNA基因序列与NCBI上RA参考菌株的基因序列相似性≥98%,说明6株分离菌均是RA;SS-RA1~SS-RA4为血清2型且含有8种毒力基因(OmpA、CAMP、wza、AS87_04050、Fur、SIP、TbdR1和luxE基因),SS-RA5和SS-RA6为血清11型,缺失AS87_04050基因,仅含有上述其余7种毒力基因;动物回归试验结果显示,攻毒组雏鸭均全部死亡,对照组雏鸭未表现明显临床症状,表明6株分离菌对雏鸭均有致病力;药敏试验结果显示,6株分离菌仅对羧苄西林、哌拉西林、头孢他啶、头孢氨苄、头孢曲松、头孢拉定和头孢哌酮7种抗菌药物敏感,对其他13种抗菌药物均表现不同程度的耐药,对氨基糖苷类和大环内酯类抗菌药物的耐药率为100%。本试验成功分离得到6株RA,为贵州省三穗县鸭疫里默氏杆菌病的疫苗选择和药物防治提供理论依据。

鸭肠炎病毒感染对鸭十二指肠转录组的影响

为探究鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)感染对鸭十二指肠黏膜组织不同时间段相关免疫基因的变化影响,采用DEV接种30日龄的健康樱桃谷鸭,在感染后72 h、96 h和120 h采集十二指肠,使用BGISEQ-500平台对3个试验组和对照组十二指肠组织测序,并筛选差异表达基因,用GO和KEGG数据库进行分析。结果显示,T72、T96和T120分别筛选出798、1389和1329差异表达基因;GO功能注释显示,差异基因主要参与到细胞因子活性、受体结合、细胞外基质、免疫系统过程、防御反应、钙离子结合、受体调节活性、受体配体活性、钠∶氨基酸转运体活性等;KEGG通路富集结果显示,差异表达基因主要涉及在细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路,抗原加工和呈递、Toll样受体信号通路、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、细胞溶质DNA传感途径、RIG-I样受体信号通路蛋白质消化吸收、细胞黏附分子(CAMs)、细胞色素P450对异生素的代谢、类固醇激素生物合成、PPAR信号通路Toll样受体信号通路、补体和凝血级联、IL-17信号通路、钠∶氨基酸转运体活性、神经递质转运蛋白活性、有机酸∶钠转运体活性、阳离子∶氨基酸转运体活性、膜的组成成分和膜的内在成分。用real-time PCR对差异表达基因的相对表达倍数进行验证,与RNA-seq测序结果基本一致。研究结果为探究DEV感染樱桃谷鸭十二指肠黏膜组织致病机制及其他生物学通路奠定了基础。

两株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为确定贵州省三穗县2个养鸭场暴发大规模雏鸭死亡的病原,本研究无菌采集2个养鸭场疑似鸭疫里默氏杆菌(Riemrella anatipestifer,RA)感染的濒死鸭的心和肝组织进行细菌分离培养。结果显示,从2个养鸭场濒死鸭肝组织中各分离到1株细菌,2株分离菌在巧克力琼脂培养基上均呈表面光滑、半透明、露滴样小菌落,镜检可见均为革兰氏阴性小杆菌;通过细菌生化试验、OmpA基因PCR扩增和玻片凝集试验对分离菌进行鉴定。结果显示2株分离菌的生化特性和OmpA基因序列均与RA相符,且均为血清11型。对雏鸭注射0.5 mL(3×10^8 cfu/mL)的分离菌纯培养液,进行致病性分析,结果显示2株分离菌均能致死试验鸭,剖检可见心和肝组织的浆膜面有纤维素性渗出,组织病理观察可见心外膜、肝被膜、脾被膜和脑膜出现纤维素性炎症。通过药敏试验和耐药基因检测对分离菌进行耐药性分析,结果显示2株分离菌对部分青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类和氯霉素类等5类抗菌药物耐药,对头孢类和喹诺酮类抗菌药物敏感;耐药基因检测结果显示,2株分离菌均携带aac(6')-Ib(氨基糖苷类)、ermF(大环内酯类)、te(t X)(四环素类)、floR(氯霉素类)和IntI1(整合子酶基因)等5种耐药基因,与耐药表型相符。本研究首次证实了血清11型RA在贵州省的存在,2株分离菌对雏鸭致病性较强且为5重耐药菌株,该结果丰富了贵州省RA的流行病学资料,为该菌的生物学特性研究和该菌感染的防控提供了科学依据。

鸭源致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与生物学特性分析

为了解嗜水气单胞菌的肉鸭健康带毒、致病与耐药情况,对贵州省三穗县某肉鸭屠宰场临床健康肉鸭随机取样,进行嗜水气单胞菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析。结果显示,分离菌具有嗜水气单胞菌典型的培养特征,菌落形态、菌体形态和生化特性均与嗜水气单胞菌相符;16 S rRNA基因序列系统进化树显示,该分离菌与嗜水气单胞菌聚为一支,同源性均>99%;动物回归试验显示,该分离菌对小鼠有较强的致病性;毒力基因PCR检测显示,该分离菌携带aer、hly、epa、act、alt和ahp等6种毒力基因;药敏试验结果显示,该分离菌对复方新诺明、磺胺嘧啶、环丙沙星和诺氟沙星等15种药物耐药;耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带qnrB、Sul1和IntI1等3种耐药基因,与药敏试验表型相符。研究结果为嗜水气单胞菌的生物学特性研究及防控提供参考依据。

1株鸭源非O1/O139群霍乱弧菌的分离鉴定与致病性分析

为探明引起贵州省某鸭场雏鸭发病的病原及其致病性和耐药情况,本研究对该鸭场送的疑似细菌感染病鸭进行剖检,取鼻黏膜、心脏和肝脏等组织器官接种于培养基中进行细菌分离鉴定,通过对分离菌进行药敏试验、动物回归试验和毒力基因检测研究其耐药情况和致病性。结果显示,分离菌在血琼脂培养基上生长16 h后呈现为边缘整齐、有光泽的乳白色菌落,伴有β-溶血现象,经革兰氏染色后在生物显微镜下呈两端钝圆、弧状、排列无规则的革兰氏阴性短小杆菌,与霍乱弧菌相符;16S rDNA基因序列同源性及系统进化树显示,该分离菌与霍乱弧菌同源性高达99.6%~99.7%聚为一支;药敏试验结果显示,分离菌对大部分药物都表现为耐药,其中对氨苄西林、克林霉素、复方新诺明、苯唑西林和克林霉素等抗菌药耐药性较强,对头孢哌酮和头孢曲松敏感;动物回归试验显示,分离菌可导致试验组雏鸭5 d内全部发病死亡,表明该分离菌对雏鸭具有较强的致病性;毒力基因PCR检测结果显示,检测的霍乱弧菌相关毒力基因hlyA、ompW和chxA为阳性,而检测的O1群rfb、O139群rfb、tcpA及ctxA基因为阴性,表明本次分离的霍乱弧菌携带有致病基因,但不属于O1和O139血清群。结果表明,该鸭场雏鸭发病的疫情病原为非O1/O139血清群霍乱弧菌,该菌致病性强且对多种抗菌药物耐药。本试验结果为贵州省鸭霍乱弧菌病的防控提供了参考依据。

鸭肠炎病毒感染对鸭肠道黏膜组织转录组变化分析

为了探究鸭肠炎病毒感染对鸭十二指肠黏膜组织相关免疫基因的变化影响,本试验采用鸭肠炎病毒接种35日龄的健康樱桃谷鸭,将其分为3组(2个试验组和1个对照组),在感染后24 h、48 h采集十二指肠,提取总RNA进行浓度、纯度及完整性检测后构建cDNA文库,使用BGISEQ-500平台对2个实验组和对照组黏膜组织测序,筛选差异表达基因,并用GO和KEGG数据库进行分析。结果显示,2个实验组感染鸭肠炎病毒后T24和T48分别筛选出共720个差异表达基因,其中T24表达上调58个,下调163个;T48表达上调77个,表达下调422个。GO功能注释结果显示,感染后差异基因都与代谢、免疫、炎症和调控途径等密切相关。KEGG通路富集分析发现,感染T24的差异表达基因富集到神经活性配体-受体相互作用、补体和凝血级联、氮代谢、cAMP信号通路和IL-17信号转导通路;感染T48的主要差异表达基因富集到神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、趋化因子信号通路、造血细胞谱系和补体和凝血级联。借助BGISEQ-500平台对鸭肠炎病毒感染后十二指肠黏膜组织相关因子的变化来探究其致病机制及其他生物学通路,弥补了非模式生物转录组研究中缺乏基因信息的不足。

鸭疫里默氏杆菌贵州流行株的分离鉴定及耐药性分析

为了解贵州省鸭疫里默氏杆菌(Riemrella anatipestifer,RA)的流行血清型和耐药情况,本试验对贵州省三穗县4个养鸭场和安顺市某养鸭场临床疑似RA感染的病鸭进行细菌分离鉴定,并对分离菌进行致病性和耐药性分析。结果显示,从疑似病料中分离到5株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特性和16S rRNA基因序列均与RA相符;5株分离菌有4株为血清2型,1株能与血清3型和血清11型RA阳性血清发生交叉凝集;动物回归试验显示,所有分离菌均可导致雏鸭发病死亡,且能复制出典型RA感染临床症状;药敏试验结果显示,所有分离菌对部分氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和氟苯尼考类抗菌药物高度耐药,对部分半合成的青霉素类和头孢类抗菌药物高度敏感;耐药基因检测结果显示,所有分离菌均携带aac(6′)-Ib、oqxA、ermF、tet(X)、floR和IntI1等6种耐药基因,与药敏试验表型相符。结果表明,贵州省三穗县目前主要流行RA血清2型,该血清型致病性强且对多种抗菌药物耐药。本试验结果为贵州省鸭疫里默氏杆菌病的防控提供了参考依据。

贵州省HPAIV和NDV免疫抗体检测及其R语言分析

为探究贵州省不同地区、养殖方式、温度和海拔对H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H7亚型AIV和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)免疫抗体阳性率的影响,采用血凝抑制试验对2015—2018年本实验室收集的贵州省各市(州)294个养殖场的鸡血清(共计11017份)进行上述疫病的免疫抗体检测,并对检测结果使用易侕统计软件(www.empowerstats.com)和R语言进行单因素和多因素分析。统计结果显示,H5,H7亚型AIV和NDV的免疫抗体阳性率分别为84.80%,64.95%和90.48%。单因素分析结果显示,H5,H7亚型AIV免疫抗体阳性率在贵州省的不同地区中差异均极显著(P<0.01);不同养殖方式对H5亚型AIV的免疫效果影响差异显著(P<0.05);不同温度对H5亚型AIV的免疫效果影响差异极显著(P<0.01);不同海拔对H5,H7亚型AIV和NDV的免疫效果影响不显著(P>0.05)。多因素分析结果显示,综合考虑不同地区、养殖方式、温度和海拔4个因素对H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率的影响,只有H5亚型AIV的免疫效果受到显著影响(P<0.05)。结果表明,贵州省H5亚型AIV和NDV的免疫抗体阳性率均达到国家农业部动物疫病监测合格要求;贵州省不同地区H5和H7亚型AIV免疫抗体阳性率存在极显著差异;不同养殖方式和温度对H5亚型AIV的免疫效果影响差异均显著;贵州省的平均海拔条件有利于H7亚型AIV和NDV的免疫防控。本研究为贵州省H5,H7亚型AIV和NDV疫苗合理免疫程序的制定提供一定的理论依据。