土壤淹水对Bt棉抗棉铃虫能力的影响

在盆栽淹灌（水层为３～４ｃｍ）１２天或在大田连续阴雨２１天的涝渍条件下，Ｂｔ棉抗棉铃虫能力显著下降。食其棉叶的棉铃虫死亡率低于正常供水的Ｂｔ棉（对照）（Ｐ＜０．０１）。当逆境解除后，棉株恢复生长，Ｂｔ棉的抗棉铃虫能力又恢复到涝渍前的水平。在涝渍逆境下，Ｂｔ抗虫棉叶中超氧物歧化酶（ＳＯＤ）活性发生急剧变化，表现为先升后降。

陆地棉（G．hirsutumL．）茎尖分生组织培养及其在基因导入上的应用

陆地棉栽培品种的种子无菌发芽１～３天。将萌动种子的顶端分生组织培养在无激素或附加低浓度激素ＭＳ基本培养基上，直接再生完整小植株。从顶端分生组织到再生植株所需的最短培养时间约１０天。顶端分生组织供体种芽的萌芽天数及其所连接的胚轴长度对植株再生频率有明显影响，但与品种的关系较小，不同品种均能获得再生植株。应用基因枪轰击法将ＣＰＴⅠ基因和ＮＰＴⅡ基因的重组质粒导入到棉花茎尖分生组织，培养获得卡那霉素抗性株。

棉属茎尖腋芽的离体培养

棉属40个不同种、远缘杂种的宿根棉株的茎尖。腋芽离体培养结果如下:在0.1mg/1ZT,0.02mg/1IBA,1.9g/1KNO_3,3％蔗糖的MS培养基上,诱导茎尖和腋芽为幼芽。幼芽诱导率达87.5％;幼芽增殖与基因型关系密切;生根诱导依赖于幼枝的生长特征,KT和IAA的配比及其含量。壮苗生长是提高试管苗移栽成活率和提高试管苗应用效果的主因。

泗棉3号叶片丛生芽形成及植株再生

泗棉３号无菌苗子叶切块在丛生芽诱导培养基中培养２０余天，直接形成芽丛，且继续长成幼枝。转移到生根培养基中的幼枝能生根，完成植株再生过程所需时间最短为７０天。

棉花体细胞培养和再生植株的素质对移植效果的影响

陆地棉新品系3118的体细胞胚状体在无激素或2倍KNO_3的MS固体培养基上发育成熟后,其植株再生率为20％。在有激素的培养基上或液体悬浮培养中发育成熟的胚状体,其植株再生率为1.2％。经壮苗培养基培养后,再生植株的单株生长量提高13.3倍,移栽成活率提高16倍。移栽56株,成活44株,移栽成活率达78.8％。在移栽成活的棉株中,正常开花结铃的可育株率为72％。

植物激素对皱壳棉外植体离体开花的影响

选用皱壳棉实生苗的微繁殖系幼枝和茎的节段作为诱导离体开花的外植体。在生长素浓度高于细胞分裂素浓度或单用生长素的培养基中，经每日１６小时光照，可诱发外植体叶腋花芽的分化和开花。但在细胞分裂素浓度高于生长素浓度的培养基中，茎节段萌发的幼芽和幼校仅呈营养生长状态。外植体产生的花器官具有正常花的主要部分，包括雄蕊，雌蕊，子房，花冠，萼片和苞叶等。

转Bt基因棉Bt毒蛋白表达量的时空变化

采用抗体夹心 EL ISA技术 ,对转 Bt基因抗虫棉植株中 Bt毒蛋白含量进行了测定。结果表明 ,Bt基因在所有检测到的器官中均有表达 ,但是不同器官中的 Bt毒蛋白含量明显不同。在苗期全展功能叶中 Bt毒蛋白含量最高 ,根、茎和叶柄中 Bt毒蛋白含量较低 ;在花铃期当日开花的子房中 Bt毒蛋白含量较高 ,雌雄蕊中 Bt毒蛋白较低 ,花瓣及苞叶 Bt毒蛋白含量最低。表明 Bt基因在不同器官中的表达强度存在差异。不同生育期的功能叶中 Bt毒蛋白含量差异显著 ,Bt毒蛋白含量在苗期叶片中最高 ,蕾期次之 ,花铃期最低。随着棉花生长发育进程的推进 ,Bt基因在叶片中的表达强度逐渐减弱。Bt基因在棉花体内的表达随着器官的不同、生育时期的不同而表现出时空动态变化。这可能是人们所观察到的转 Bt基因抗虫棉对棉铃虫抗性呈时空动态变化的根本原因。

转基因抗虫棉的抗性鉴定

１９９４～１９９５年采用棉铃虫初孵幼虫鉴定Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３代Ｂｔ转基因棉花２０００多株次，筛选出Ｒ１代抗虫效果达８０％以上的单株１１个，占参测株６．２１％；Ｒ２代（株系）１５个，占参测株系１３．８９％；Ｒ３代３７５株，占参测株７１．２９％。１２份材料进入复鉴，８份材料在罩笼接虫中，百株活虫数及被害蕾铃率平均比对照分别减少８８％～１００％及９０％～１００％；叶、蕾饲喂棉铃虫３龄幼虫，毒性效果均在８０％以上，３龄棉铃虫幼虫取食抗虫棉后，取食量、排泄量及体长和体重增长率比对照减少５０％～１０７％，第四天出现死虫，且对红铃虫亦有较强的抗性。

转基因抗虫棉组织中Bt毒蛋白表达量的ELISA测定

利用抗体－抗原－酶标抗体反应，建立了间接酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ），以检测转基因抗虫棉品系３１０幼叶Ｂｔ毒蛋白含量。初步测定结果：转基因抗虫棉幼叶中Ｂｔ毒蛋白含量为总可溶性蛋白质的（０．１２６±０．００８）％。提纯的伴胞晶体样品经ＥＬＩＳＡ法检测，其Ｂｔ毒蛋白最低可检值为２０ｎｇ／ｍｌ。这一检测技术既可对转基因抗虫棉组织中Ｂｔ毒蛋白表达量进行定性、定量测定，也为阐明转基因抗虫棉的抗虫特性提供了理论依据。

转Bt基因棉Bt毒蛋白的ELISA检测方法的研究(英文)

利用纯化的Ｂｔ毒素蛋白（６７ｋＤａ）作为标准蛋白和免疫抗原，建立了检测转基因抗虫棉植株内Ｂｔ毒蛋白含量的抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法。检测极限１μｇ·Ｌ－ １，线性范围１－ １５μｇ·Ｌ－ １，板内误差Ｃ．Ｖ．＜ ５％ ，板间误差Ｃ．Ｖ．＜ ５％ ，平均样品回收率９４．９４％ 。经稀释度试验等质量控制试验，表明所建立的ＥＬＩＳＡ方法是可靠的，可用于转基因棉花植株中Ｂｔ毒素蛋白含量的测定。

6BA和AgNO_3对甘蓝型油菜带柄子叶外植体不定芽再生的影响

通过研究两个甘蓝型油菜 (BrassicanapusL )亲本材料“宁A6”和“宁R1”带柄子叶外植体不定芽再生能力 ,探明了 6BA和AgNO3 浓度对外植体不定芽再生能力影响效果 ,并确定了促进两种不同基因型甘蓝型油菜不定芽再生的最适 6BA和AgNO3 浓度。组织学观察表明 。

转Bt杀虫蛋白基因的抗棉铃虫棉花新种质

采用花粉管通道途径,将合成的 Bt 杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉所12号,获得了转基因植株。组织化学分析表明,GUS 标记基因已在 R_1代植株中得到表达。据对 GUS 阳性转基因棉株的 PCR 分析结果,证明 Bt 杀虫蛋白基因出现在 R_1代中,并通过自交传递至 R_2代。经鉴定,获得了5株对棉铃虫幼虫有高度毒杀作用的 R_1代单株S545、S591、S636、S1001(泗棉3号+Bt/GUS)及 Zh1109(中棉所12号+Bt/GUS),棉铃虫幼虫致死率分别达到91.6%、93.8%、92.3%、85.7%、75.0%。并由 R_1代自交后形成 R_2代抗虫棉群体,表明获得了抗棉铃虫棉花新种质。

棉花茎尖分生组织在微粒轰击法基因转化中的应用

利用棉花茎尖分生组织易于再生成完整植株的特点，结合使用基因枪轰击法将ＣＰＴＩ基因导入棉花茎尖分生组织。经过再生、筛选等培养过程已获得若干卡那霉素抗性株。棉花品种、棉株茎尖的发育天数及茎尖附带的下胚轴长度等对转化效果都有不同程度的影响。筛选的起始时间、培养基的转换时间及卡那霉素的浓度梯度等因素对筛选效果有明显影响。

结球甘蓝的离体再生及基因转化条件研究

以结球甘蓝鸡心２３、晨光５１号两个自交不亲和系种子的无菌苗的下胚轴为外植体材料，在附加１ｍｇ／ｌＢＡ、１ｍｇ／ｌＺＴ、０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡ或２ｍｇ／ｌＺＴ、０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡ的稍作修改的ＭＳ培养基上诱导不定芽发生，不定芽诱导频率分别为８６．４％、１００％和８６．３％、４０．６％。头孢霉素有抑制结球甘蓝下胚轴诱导不定芽的作用，羧苄青霉素则能保持原有的不定芽诱导频率。卡那霉素在诱导不定芽的过程中，有完全抑制其发生的作用，而在不定芽和幼苗生长阶段则有筛选作用。卡那霉素敏感性测定结果，１０ｍｇ／ｌ卡那霉素为适宜的选择浓度。以下胚轴的切段为受体，应用农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（ＣｐＴＩ）和新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴＩＩ）重组质粒导入结球甘蓝。

陆地棉胚性愈伤组织诱导和植株再生

以陆地棉“泗棉３号”、“北无２０３１”、“鲁棉９５５４”为材料进行全固体体细胞培养，获得了胚性愈伤组织和再生植株。起始愈伤组织阶段，用含２，４－Ｄ０．１ｍｇ／Ｌ、ＫＴ０．１ｍｇ／Ｌ和２，４－Ｄ０．１ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ、ＺＴ０．１ｍｇ／Ｌ的培养基效果较好；进入胚性愈伤组织诱导阶段，在含ＩＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ、ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ的培养基上胚性愈伤组织诱导频率较高。使用ＳＨ培养基或将ＭＳ培养基ＮＨ４ＮＯ３的浓度降为０．３ｇ／Ｌ，可大幅度提高胚性愈伤组织诱导频率。在胚状体萌发培养基中添加２５０ｍｇ／Ｌ活性炭，可减轻胚状体褐化率，提高成苗率。对于在萌发培养基中未能长出真叶的胚状体，可将其转至添加ＩＢＡ０．４ｍｇ／Ｌ、ＫＴ０．１ｍｇ／Ｌ的培养基，部分胚状体能培养成苗。

棉花(Gossypium hirsutum L.)原生质体培养的体细胞胚胎发生及植株再生

以陆地棉(G.hirsutum L.)3118、晋棉4号和柯字棉312等3个品种为材料,取种子无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织,建立胚性细胞悬浮培养系。以2％纤维素酶Ono-zuka RS和0.1％离析软化酶Y-23组成的混合酶液,从细胞悬浮培养物游离出原生质体。用含低融点琼脂糖的K_3培养基包埋原生质体,采用园柱及薄层漂浮平板培养方式。3个品种的原生质体培养都得到了愈伤组织,其中晋棉4号和柯字棉312品种的愈伤组织转到低激素水平或无激素的MS-2培养基上诱导产生胚状体,胚状体在无激素的MS-1培养基上形成了植株。

氮源和激素对陆地棉原生质体体细胞胚胎发生和发育的影响

以陆地棉品种一柯字棉312原生质体再生的愈伤组织为材料,在附加0.5 mg╱1 2,4-D和KT的MS-1培养基上诱导培养,然后转到无激素的MS-2或MS-3培养基上,诱导胚状体发生。在MS-2培养基上,多数胚状体发育处于球形期;而在MS-3培养基上,球形胚进一步发育为心形胚和鱼雷形胚。附加0.1 mg╱1 ZT和IAA不仅增加胚状体发生的数量,而且促进胚状体的发育,胚状体的萌发率达70％以上。鱼雷形胚状体或已萌发的胚状体在无激素的MS-1培养基上形成正常的再生植株,在附加激素的MS-1培养基上则产生畸型株。

结球甘蓝无菌苗子叶和下胚轴诱导再生植株

在植物遗传转化研究中,外植体通过不定芽诱导途径再生植株有利于保持原有品种或材料的优良农艺性状,再转移进由某一目的基因控制的特定性状即可达到品种改良的目的。虽然已有从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.copitata)种子无菌苗的子叶柄切口和下胚轴切段诱导不定芽发生的报道,但不定芽的诱导频率仅为4%左右。

慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因导入棉花获得转基因植株

通过花粉管通道技术将慈姑蛋白酶抑制剂API(ArrowheadProteinaseInhibitor)基因转入棉花 ,获得了转基因植株。经对棉铃虫抗虫性鉴定和PCR、RT PCR、Southernblotting分析 。