用快速斑点免疫金渗滤法检测抗SSA抗体

目的建立一种简便、快速、可靠的检测抗SSA抗体的方法。方法将重组的SSA抗原包被于硝酸纤维素(NC)膜上,以胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(StaphylococusproteinA,SPA)作为显示剂,建立一种检测抗SSA抗体的快速斑点免疫金渗滤法(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)。结果本法对系统性红斑狼疮(SLE)阳性率为100%,对皮肌炎(DM)阳性率为100%,狼疮性肾炎(LN)阳性率为75%,本法与免疫印迹法(IBT)的符合率为94.1%。IBT法阴性的50例病人中,本法检出3例阳性病例(其ANA均为阳性);健康体检50例均为阴性。结论本法简便、快速、可靠,整个检测过程只需2min,不需其他特殊设备。

应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性

目的建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法。方法抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23SrRNA区187bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序。结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100%,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致。结论 DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景。

系统性红斑狼疮患者体液免疫功能分析

目的探讨体液免疫功能在系统性红斑狼疮(SLE)中的作用。方法选取53例SLE患者及50例健康对照者,应用速率散射比浊法检测外周血中的IgG、IgA、IgM、C3、C4、κ、λ,应用流式细胞术检测外周血中的CD19。结果SLE组IgG、IgA、κ、λ及CD19均升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。SLE组C3、C4、κ/λ降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。SLE组IgM虽有降低,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论检测SLE患者体液免疫功能,有助于SLE疾病的诊断、治疗及监测。

系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞亚群分析

目的探讨T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞在系统性红斑狼疮(SLE)中的作用。方法利用流式细胞仪对29例活动期、24例非活动期SLE患者及50例健康对照者的外周血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD3-CD16+CD56+(NK)及CD19+(B)淋巴细胞进行检测。结果活动期组与非活动期组及健康对照组比较:CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值及NK细胞明显降低(P<0.05),B淋巴细胞明显增高(P<0.05),CD3+T和CD8+T淋巴细胞无统计学意义(P>0.05)。非活动期组与健康对照组比较,T淋巴细胞各亚群、NK细胞及B淋巴细胞均无统计学意义(P>0.05)。结论检测外周血淋巴细胞亚群,对判断病情及指导临床治疗具有重要意义。

应用限制性片段长度多态性检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性

目的建立限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)快速检测HP对克拉霉素耐药性的方法。方法抽提37例经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的HP菌株DNA及其对应的胃黏膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23S rRNA区425 bp基因,运用RFLP技术,采用BbsⅠ和BsaⅠ内切酶对PCR产物进行酶切分析,并进行DNA测序。结果37例克拉霉素耐药的HP菌株DNA经RFLP分析,21例能被BbsⅠ内切酶切开,13例能被BsaⅠ内切酶切开,3例不能被BbsⅠ和BsaⅠ内切酶切开,而且37例组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致。结论RFLP可应用于HP对克拉霉素耐药性的快速检测,为临床用药提供指导。

慢性肾小球肾炎患者免疫功能分析

目的分析慢性肾小球肾炎患者免疫功能。方法收集100例慢性肾小球肾炎患者和30例健康体检者血清,用免疫比浊法测定IgG、IgA、IgM、C3和C4等体液免疫指标,用流式细胞法测定CD3、CD4、CD8、CD19(B细胞)和CD16+56+(NK细胞)等细胞免疫指标。结果慢性肾小球肾炎组的体液免疫指标中IgG、IgA、IgM、C3和C4都明显降低(P<0.05),细胞免疫指标中CD3、CD4和CD8百分比明显增加(P<0.05),而绝对计数却减少,其中以CD4绝对计数降低最明显(P<0.05),B细胞和NK细胞百分比和绝对计数均明显降低(P<0.05)。结论慢性肾小球肾炎患者免疫功能降低。

四种血细胞分析仪检测结果的对比分析

目的评价四种血细胞分析仪的主要测定指标的可靠性。方法根据1986年国际血液学标准化委员会ICSH公布的关于自动血细胞计数仪评价的文件,用标准全血质控液以白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)及血小板(PLT)4个测试项目评价Beckman Coulter LH750、Beckman Coulter ACT5dif、Abbott Cell Dyn3700以及迈瑞BC5500四种血细胞分析仪的批内精密度、批间精密度等指标,然后比较150份新鲜全血样本在四种仪器上的测定结果。结果四种血细胞分析仪的批内精密度、批间精密度等结果经单个样本t检验差异无统计学意义(P>0.05);临床标本在四种仪器上的测定结果经方差分析差异无统计学意义(P>0.05)。结论四种血细胞分析仪的主要性能指标均符合要求,四项测定指标结果差异在允许范围内;同一实验室对不同血细胞分析仪结果进行定期比对和偏差评估是十分重要的,是保证检测结果准确可靠的有效方法。

抗Sm D1抗体在系统性红斑狼疮诊断中的应用

目的探讨抗Sm D1抗体在系统性红斑狼疮(SLE)诊断中的应用。方法 93例SLE患者、15例皮肌炎患者、30例干燥综合征患者和50例健康体检者血清用线性免疫分析法检测抗Sm D1抗体,免疫印迹法检测抗Sm抗体,间接免疫荧光法检测抗ds-DNA抗体。结果 SLE患者抗Sm D1抗体的阳性率高于抗Sm抗体(P<0.01),与抗ds-DNA抗体阳性率相似(P>0.05),在非SLE患者中抗Sm D1抗体均阴性。结论抗Sm D1抗体是SLE的特异性指标,其敏感性高于抗Sm抗体,可作为SLE实验室诊断的常规项目之一。

前列腺特异性抗原及其分子亚型检测的临床意义

1979年Wang首次成功地从前列腺组织中分离和提纯出分子量为35000的糖蛋白并命名为前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA），PSA已成为临床上最常用的诊断前列腺癌（prostate cancer）的肿瘤标记物。随着研究的不断深入。人们发现PSA还存在多种分子亚型。而且这些分子亚型对于前列腺癌的早期诊断更为敏感和特异。从而为前列腺癌和前列腺良性增生（benign prostic hyperplasia）的鉴别以及前列腺癌的早期诊断提供了新的手段。

Smith抗原的性质特征及临床意义

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,患者血清中可检出多种自身抗体,但抗Sm ith(Sm)抗体是SLE的标记性抗体。作者就Sm抗原的理化特性、生物学作用和抗Sm抗体的检测作一综述。

白介素检测在急性胰腺炎鉴别诊断中的应用

目的探讨白介素(IL)检测在急性胰腺炎鉴别诊断中的应用.方法选取急性胰腺炎患者30例,胰腺癌确诊患者30例,同时选取30例健康体检者为对照组,采用化学发光法分别检测IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8和IL-10.结果急性胰腺炎组的IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10高于胰腺癌组和健康对照组(P<0􀆰05),急性胰腺炎组的IL-2R与胰腺癌组差异无统计学意义(P>0.05),但高于健康对照组(P<0.05),胰腺癌组的IL-1β、IL-2R、IL-6和IL-8高于健康对照组(P<0.05),而胰腺癌组的IL-10与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10检测可用于急性胰腺炎的鉴别诊断.

成人血清IL-1β、IL-2r、IL-6、IL-8和IL-10正常参考区间的建立

目的建立成人血清IL-1β、IL-2r、IL-6、IL-8和IL-10正常参考区间。方法收集健康体检者180例,利用Immulite 1000自动化学发光免疫分析仪检测血清IL-1β、IL-2r、IL-6、IL-8和IL-10的水平。结果成人血清IL-1β、IL-2r、IL-6、IL-8和IL-10的95%正常参考区间分别为:<5 pg/mL、<572 U/mL、<2 pg/mL、<70.5 pg/mL和<5 pg/mL。结论初步建立本实验室Immulite 1000自动化学发光免疫分析仪成人血清IL-1β、IL-2r、IL-6、IL-8和IL-10正常参考区间。

miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达对多发性骨髓瘤细胞自噬及凋亡的影响

目的:探讨多发性骨髓瘤细胞miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达与自噬和凋亡的关系。方法:选取人骨髓瘤细胞株U266及正常CD138+浆细胞为研究对象,临床研究对象分为骨髓瘤组45例,健康对照组40例。实时定量PCR测定细胞中miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达水平,Western blot测定自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ,LC3-Ⅰ、P62、Beclin-1)表达量,凋亡相关分子(cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase7、BCL-2、BAX)表达量;流式细胞术测定细胞凋亡率。分析miRNA表达水平与临床相关指标包括M蛋白、血红蛋白、β2-MG、乳酸脱氢酶、白蛋白、肌酐、血清钙的相关性。结果:与正常浆细胞对比,骨髓瘤细胞的miRNA-132和miRNA-125b表达显著增加(P <0.05),miRNA-143,miRNA-145表达显著降低(P <0.05);LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著增加(P <0.05),Beclin-1表达显著增加(P <0.05),P62表达显著降低(P <0.05);BAX、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase7表达显著降低(P <0.05),BCL-2表达显著增加(P<0.05);细胞凋亡率降低(P <0.05)。阳离子脂质体转染miRNA-125b mimic和miRNA-143 inhibitor后,正常浆细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著增高(P <0.05),Beclin-1表达显著增高(P <0.05),P62表达也显著增加(P <0.05),细胞凋亡率降低(P <0.05);上述反应体系加入自噬抑制剂3-MA后,细胞凋亡率则无明显改变(P> 0.05)。miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达在不同DS与ISS分期组,染色体核型异常组与正常核型组间均有显著性差异(P <0.05)。miRNA-125b和miRNA-143与β2-MG、白蛋白、血红蛋白水平均有显著相关性(P <0.05)。结论:miRNA-132、 miRNA-125b、 miRNA-143和miRNA-145表达与多发性骨髓瘤患者临床特征密切相关,miRNA-125b过表达和miRNA-143表达下调通过上调自噬水平抑制骨髓瘤细胞凋亡。

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。

热休克蛋白27通过降低内质网应激抑制硼替佐米诱导的骨髓瘤细胞凋亡

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)细胞热休克蛋白27(HSP27)表达对硼替佐米诱导凋亡的影响及机制。 方法 人MM细胞株U266细胞暴露于硼替佐米,实时荧光定量PCR检测HSP27mRNA,蛋白质印迹法检测HSP27、磷酸化-HSP27(p-HSP27)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/9(cl-Caspase3/9)表达。收集12例初治和10例复发MM患者骨髓瘤细胞,荧光原位杂交法检测染色体异常,比较HSP27mRNA和蛋白表达差异。将U266细胞分为观察组和对照组,分别转染HSP27-siRNA和NC-siRNA,流式细胞术检测硼替佐米诱导的细胞凋亡率。慢病毒介导HSP27基因在U266细胞过表达,蛋白质印迹法检测硼替佐米诱导的GRP78和cl-Caspase3表达。 结果 硼替佐米暴露显著上调U266细胞HSP27mRNA和蛋白的表达(P<0.01),上调GRP78和p-PERK表达(P<0.05),活化Caspase-3和Caspase-9(P<0.05);4-苯基丁酸预处理显著抑制硼替佐米诱导的Caspase-3和Caspase-9活化(P<0.01)。复发MM患者HSP27mRNA和蛋白的表达显著高于初治MM患者(P<0.01)。沉默HSP27表达显著增加硼替佐米诱导的U266细胞凋亡(P<0.01)。慢病毒介导HSP27过表达显著抑制硼替佐米诱导的GRP78表达和Caspase-3活化(P<0.01)。 结论 HSP27负反馈抑制内质网应激,减少硼替佐米诱导的MM细胞凋亡。

血清HE4、CA-125和ROMA指数在盆腔恶性肿瘤中的诊断价值

目的探讨血清中人附睾分泌蛋白4(HE4)、糖类抗原125(CA-125)水平和卵巢癌风险预测模型(ROMA)在盆腔恶性肿瘤中的诊断价值。方法采用电化学发光免疫测定卵巢癌组、子宫内膜癌组、宫颈癌组、卵巢良性肿瘤组、子宫良性疾病组以及对照组的血清HE4和CA-125水平,并结合绝经状态计算ROMA值。结果 (1)卵巢癌组和子宫内膜癌组血清HE4的表达水平明显高于其它各组(P<0.01);卵巢癌组血清CA-125的表达水平明显高于除子宫内膜癌组的其它各组(P<0.01);卵巢良性肿瘤组及子宫良性疾病组血清CA-125的表达水平明显高于对照组(P<0.05)。(2)以卵巢良性肿瘤组为对照组,绝经前HE4对卵巢癌的特异性和阳性预测值高达100%,准确性93.9%,均明显高于CA-125和ROMA值(P<0.01);CA-125对卵巢癌的敏感性最高88.9%,与HE4比较差别有统计学意义(P<0.05)。绝经后三指标在对卵巢癌的特异性、敏感性和准确性上差别无统计学意义(P>0.05)。不考虑绝经与否,HE4的特异性、阳性预测值和准确性最高(98.1%、91.7%和91.4%);ROMA指数的敏感性和阴性预测值最高(81.3%和93.6%)。(3)以卵巢良性肿瘤+健康人为参照人群,HE4、CA-125和ROMA指数单项检测诊断卵巢癌的ROC曲线下面积分别为0.919、0.814和0.921。以子宫良性疾病组为对照组,单独检测HE4在诊断子宫内膜癌的特异性、阳性预期值和准确性方面均明显高于CA-125(P<0.05);HE4与CA-125联合检测子宫内膜癌的敏感性高于单独检测。以子宫良性疾病组+健康人为参照人群,HE4、CA-125单项检测诊断子宫内膜癌的ROC曲线下面积分别为0.916、0.731。结论血清HE4对卵巢癌和子宫内膜癌具重要诊断价值,其鉴别诊断效能优于CA-125,且与CA-125联合检测有助于提高子宫内膜癌的诊断率;ROMA指数的应用有助于提高对卵巢癌的诊断效能。

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法:PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Jo-1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用SDS-PAGE和免疫酶斑点法鉴定。结果:PCR产物长约1500bp,与预期1526bp接近;pPIC9k-Jo-1重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库的报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Jo-1的相对分子质量约55000,免疫酶斑点法证实表达产物具有天然Jo-1分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。结论:Jo-1在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,为后续研究打下了基础。