梅毒螺旋体TpN15抗原重组表达及rTpN15-ELISA血清学检测效果

目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpN15基因原核表达系统,建立基于rTpN15的ELISA并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpN15基因,构建tpN15基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN15表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN15,Western blot鉴定rTpN15的免疫反应性。以rT-pN15为包被抗原,建立rTpN15-ELISA并用于检测138例梅毒病人血清,其检测结果与RPR和TPHA进行比较。结果:克隆的tpn15基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rTpN15表达量为细菌总蛋白的23.4%。提纯的rTpN15在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。TPHA阳性的梅毒病人血清能有效识别rTpN15并与之结合。rTpN15-ELISA对梅毒病人血清标本检测阳性率为96.4%(133/138),与TPHA检测阳性率(97.8%,135/138)相近(P>0.05),rTpN15-ELISA和TPHA检测阳性率均显著高于TRUST(82.6%,114/138)(P<0.01)。结论:本研究中成功地克隆并构建了梅毒螺旋体tpN15基因及其原核表达系统。以rTpN15为包被抗原的rTpN15-ELISA可作为快速、简便、敏感和特异的梅毒血清学筛查方法。

淋病奈瑟菌pIB基因的克隆、原核表达及其表达产物免疫学鉴定

目的:分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白pIB基因核苷酸及氨基酸序列,构建pIB基因的原核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性,检测标本中pIB基因的表达情况。方法:采用PCR扩增淋病奈瑟菌ATCC49226株的全长pIB基因,T-A克隆测序后与GenBank中相应序列进行相似性比较并构建pIB基因的原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rPIB表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rPIB。rPIB免疫家兔以了解其抗原性并采用免疫双扩散试验检测抗血清的效价。采用Western Blot检测rPIB的免疫反应性。建立PIB-ELISA检测标本中pIB基因的表达情况。结果:与GenBank中相应序列比较,克隆的pIB基因核苷酸和氨基酸序列完全相同。rPIB表达量为细菌总蛋白的21.5%,提纯的rPIB经SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。rPIB能诱导家兔产生特异性抗体,其免疫双扩散效价为1:4。pIB+淋病奈瑟菌感染的病人血清能与rPIB产生阳性Western杂交条带。PIB-ELISA检测淋病病人的脓性分泌物标本的阳性率为82.3%。结论:结果表明本研究成功地克隆并构建淋病奈瑟菌pIB基因及其原核表达系统,该表达系统能有效地表达rPIB。rPIB有良好的抗原性和免疫反应性,rPIB免疫家兔制备的抗血清特异性高。可作为研制淋病基因工程疫苗及实验室诊断方法的侯选抗原。