过氧化氧化还原蛋白2在结直肠癌中的表达及其作用机制的研究

目的:探讨过氧化氧化还原蛋白2(peroxiredoxins 2,PRDX2)在结直肠癌及正常结直肠组织中的表达情况及其可能的作用机制。方法:收集32例组织标本,采用免疫组织化学及Western blot的方法对PRDX2在结直肠癌组织及正常结直肠组织中的表达情况进行检测;免疫共沉淀及HPLC-CHIP-MS/MS方法检测结肠癌细胞SW480中与PRDX2相互作用的蛋白质。结果:免疫组织化学显示:PRDX2蛋白主要表达于细胞浆,在结直肠正常组织(21.88%,7/32)与结直肠癌组织中(71.88%,23/32)PRDX2蛋白的表达差异有统计学意义(P=0.001)。随机抽取8例标本进行Western blot的检测,PRDX2蛋白在7例癌组织中表达高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.01)。在结肠癌细胞SW480中鉴定出17种与PRDX2相互作用的蛋白质,其中有9种蛋白受c-Myc基因的调控。结论:PRDX2在结直肠癌的发展、转移中发挥了一定的作用;PRDX2可能与c-Myc基因调控通路间存在密切的联系。

Survivin基因的shRNA干扰对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响

目的:以携带shRNA片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法:将构建好的携带Survivin-shRNA片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数(MOI)下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V—FITC和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝(MTT)法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果:腺病毒转染后MOI值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI值为50并进行后续实验;shRNA干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G_1/S期细胞增多和G_2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义(P<0.05)。MTT和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用(P<0.05)。结论:采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G_1/S期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。

裸小鼠人大肠癌淋巴道转移模型的建立

目的建立一种人大肠癌简便、可行、稳定的淋巴道转移研究动物模型。方法裸鼠爪垫皮下注射人结肠癌HCT-116细胞，接种后在1～6周及8周不同时间段取材；收集腹股沟、胭窝，髂血管旁，肾门淋巴结以及肝肺脏器；进行HE染色及CEA免疫组化检测。观察种植瘤的成瘤率、生长情况以及淋巴结转移规律。结果爪垫种植1周后成瘤率100%。3周后淋巴结开始转移，到6周时第一级腹股沟胭窝淋巴结完全转移，转移率100％，其中腹股沟淋巴结转移阳性率76．9％（10／13）；第二级髂血管旁淋巴结部分转移，转移率40％（2／5）；未见第三级肾门淋巴结转移。到8周时见髂血管旁淋巴结转移率60％（3／5），肾门淋巴结开始转移（1／5），但均未见肝肺远处转移。HE染色及CEA免疫组化染色发现淋巴结有弥漫性癌细胞浸润。结论裸鼠爪垫皮下注射可成功建立人大肠癌淋巴道转移模型。此模型快速简便、转移集中、转移率高，可为研究结直肠癌淋巴道转移机制，药物干预等抗转移治疗提供理想的动物模型。

VEGF上调不同类型细胞Survivin的表达

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)对结肠癌细胞(LOVO、HCT116)、人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)Survivin表达的影响和存在的差异。方法VEGF刺激体外培养的LOVO、HCT116、HUVECs并检测细胞周期和凋亡的变化,用RT-PCR测定mRNA表达,Western blot测定蛋白表达,用免疫细胞化学测定Survivin蛋白表达和部位。结果VEGF可促进肿瘤细胞增殖,在结肠癌细胞中Survivin表达水平较高,在VEGF诱导后表达上调(P<0.05),主要分布在细胞质;在HUVECs中,Survivin表达不明显,VEGF诱导后表达明显上调(P<0.05),在细胞质和细胞核中均有较高表达。结论VEGF上调3种细胞SurvivinmRNA和蛋白表达,但在肿瘤和非肿瘤细胞Survivin上调的程度和分布存在差异。

鞣酸通过下调TMEM16A的表达抑制人结肠癌细胞SW620细胞的增殖

目的：探讨鞣酸对人结肠癌SW620细胞增殖及TMEM16AmRNA与蛋白水平的影响。方法将对数生长期的人结肠癌细胞SW620分为3组，分别是鞣酸低剂量组（50μmol/L）及高剂量组（100μmol/L），以及二甲基亚砜（DMSO）作为空白对照组，培养48、72h。MTT法检测细胞的增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期的分布及凋亡情况，RT-PCR和Westernblot分别检测TMEM16A的mRNA水平和蛋白水平。计量资料采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。结果MTT结果显示：鞣酸处理能显著抑制SW620的增殖。高剂量组对SW620细胞的抑制作用比低剂量大。处理48h，高剂量组比低剂量组抑制作用明显（t＝15．35，P＜0．01）；处理72h，高剂量组同样比低剂量组抑制作用明显（t＝22．32，P＜0．01）。流式细胞检测结果显示：与对照组相比，各个剂量组都能显著将SW620细胞抑制在G0/G1期和S期（F＝6782．1、1509．3，P＜0．01），G2/M期的细胞比例差异无统计学意义（F＝1．37，P＞0．05）。各个剂量组处理后，凋亡率差异有统计学意义（F＝545．3，P＜0．01）。与对照组比较，鞣酸高剂量组的3H-TdR、3H-Leucine掺入量在48、72h均明显低于对照组（P＜0．05）。鞣酸低剂量组药物干预48、72h后TMEM16AmRNA相对表达量分别为0．63±0．01和0．62±0．01；鞣酸高剂量组药物干预48、72hTMEM16AmRNA相对表达量分别为0．58±0．01和0．50±0．01，均低于空白对照组的0．85±0．01（F＝7．645，P＜0．05）。鞣酸低剂量组药物干预48、72h后TMEM16A蛋白相对表达量分别为0．68±0．14和0．65±0．12；鞣酸高剂量组药物干预48、72hTMEM16蛋白相对表达量分别为0．64±0．15和0．63±0．11，低于空白对照组的1．28±0．06（F＝4．508，P＜0．05）。结论鞣酸能明显抑制人结肠癌细胞SW620细胞的增殖，将其细胞周期阻滞于G1～S期，并下调TMEM16A的mRNA及蛋白水平。

间歇性缺氧对SW480细胞生长及HIF-1α表达的影响

目的:研究间歇性缺氧(Intermittent hypoxia,IH)对SW480细胞生长及缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响,探讨肿瘤的间歇性缺氧现象及与HIF-1α的关系。方法:采用氯化钴(CoCl2)模拟缺氧环境,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察间歇性缺氧对SW480细胞生长的影响,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot检测间歇性缺氧对HIF-1α表达的影响。细胞分组:A组:常氧组;B组:间歇性缺氧2h组;C组:间歇性缺氧3h组;D组:持续性缺氧3h组。结果:MTT结果显示3个缺氧组与常氧组相比,SW480细胞增殖活性均受到抑制,C组和D组较B组增殖活性亦降低,而C组和D组之间无差异。RT-PCR检测HIF-1αmRNA发现C组高于A组、B组及D组。而其余各组之间无差异。Western blot检测HIF-1α蛋白发现C组高于其余各组,D组高于B组及A组,而B组与A组无差异。结论:相同缺氧时间,不同缺氧方式使SW480细胞生长受到同等程度抑制。一定程度的间歇性缺氧可以上调HIF-1αmRNA及蛋白水平。

Peroxiredoxin 2基因慢病毒载体的构建及对结直肠癌SW480细胞增殖的影响

目的:构建Peroxiredoxin 2(Prdx2)基因慢病毒表达载体,建立能够稳定高表达Prdx2的结直肠癌SW480细胞株,研究Prdx2的高表达对SW480细胞生长增殖的影响。方法:利用PCR扩增Prdx2编码区片段,克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin(GV218)中,构建Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)慢病毒表达载体,包装产生慢病毒颗粒,鉴定后将其转染SW480细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot方法检测SW480细胞中Prdx2的mRNA和蛋白水平表达情况;MTT法检测细胞生长情况;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果:构建的重组慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)经鉴定正确;慢病毒转染SW480细胞后,细胞中Prdx2在mRNA和蛋白水平高表达。MTT法及平板克隆形成实验结果显示Prdx2高表达的SW480细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。结论:成功构建Prdx2基因慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin,筛选出稳定高表达Prdx2的SW480细胞株;高表达的Prdx2分子可显著促进结直肠癌SW480细胞增殖。

外源性VEGF对结肠癌细胞SW480蛋白质变化的影响

利用RT-PCR发现结肠癌细胞存在血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)的表达,随后采用外源性VEGF对结肠癌细胞SW480进行体外刺激,流式细胞仪检测到结肠癌细胞刺激后快速进入分裂期,同时提取VEGF作用前后的结肠癌细胞总蛋白,蛋白质组学研究,发现存在明显的蛋白质变化,其中鉴定出10个差异蛋白质.提示外源性VEGF可以促进结肠癌细胞增殖并对肿瘤细胞蛋白质组产生明显的影响.

270例胃肠间质瘤基因突变谱及与临床病理特征关系

目的 :分析研究270例胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)患者c-kit及血小板源性生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptorα,PDGFRA)基因突变特点及与临床病理特征的关系。方法 :回顾性收集2016年6月至2019年1月重庆医科大学附属第一医院收治的270例GIST患者基因检测结果和临床病理资料,分析两者之间的关系。结果 :(1)270例患者中220例检测到c-kit突变,突变最常发生于11号外显子,其次为9号外显子。9号外显子均为A502-Y503重复突变。11号外显子主要为缺失突变和点突变,最常发生于557~560位点。7例PDGFRA突变中以D842V突变最常见。(2)c-kit 11突变中点突变和混合突变发生在胃上的概率小于其他类型突变(P=0.022)。c-kit 11突变患者中大于50岁的频率高于其他c-kit突变(P=0.040)。c-kit 9突变发生在小肠上的频率大于其他突变(P=0.000)。PDGFRA突变与野生型患者核分裂象<5/50 HPF的比例大于c-kit突变的患者(P=0.027)。c-kit突变患者CD117阳性率大于PDGFRA突变与野生型(P=0.000)。野生型患者平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)阳性率高于突变型(P=0.002)。结论:GIST患者发生c-kit/PDGFRA突变的频率高,且突变位点、类型多样与临床病理特征关系密切,是GIST患者个体化治疗的重要依据。

沉默PLD2基因对结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的:探讨沉默磷脂酶D2(phospholipases D2,PLD2)基因的表达对人结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响及其潜在的分子机制。方法:采用载有靶向PLD2的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)腺病毒转染SW480和SW620细胞;q RTPCR和Western blot法检测转染后结肠癌细胞PLD2的m RNA和蛋白质表达的变化;平板克隆形成实验和Transwell小室分别检测各组细胞的增殖和细胞迁移能力的变化;采用Western blot法检测转染前后细胞中周期蛋白D1(Cyclin D1)和基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)蛋白的表达。结果:转染PLD2 si RNA后结肠癌细胞PLD2 m RNA和蛋白的表达量明显下降(均P<0.01),沉默PLD2表达后细胞的增殖和迁移能力明显受抑制,同时Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达量也明显下调(均P=0.000)。结论:干扰PLD2表达引起的细胞增殖和迁移能力的下降可能与Cyclin D1和MMP-2表达下调密切相关,提示PLD2可能成为结肠癌治疗的新靶点之一。

经腹与腔内超声联合检查与增强CT在胃肠间质瘤分子靶向药物疗效评估中的对比研究

目的:探讨经腹与腔内超声联合检查在胃肠间质瘤分子靶向药物疗效评估中的价值。方法:回顾性分析35例经病理证实并行分子靶向药物治疗的胃肠间质瘤患者的超声及增强CT检查资料,以实体瘤疗效反应的评价标准(the response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)作为评估标准,比较2种影像检查方法评估药物疗效的一致性。结果:超声与增强CT 2种检查方法在胃肠间质瘤分子靶向药物疗效评估中的结果一致性满意,Kappa值为0.821 (P<0.001),2种检查的评估结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论:超声在评价胃肠间质瘤分子靶向药物疗效方面与增强CT具有一致性,可作为评估胃肠间质瘤分子靶向药物疗效一种影像检查方法。

PRDX1在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨过氧化氧化还原蛋白1(PRDX1)在结直肠癌组织及远处正常组织中的表达情况及其与患者临床病理资料间的关系。方法采用免疫组织化学对32例结直肠癌组织及相应的远处正常组织中PRDX1的表达情况进行检测,随机抽取8例标本采用蛋白质印迹的方法进行验证;将PRDX1的表达情况与患者的性别、年龄、肿瘤分期、淋巴结转移等临床病理资料进行统计学分析。结果免疫组织化学显示,PRDX1蛋白主要表达于细胞质,在结直肠癌远处正常组织中的表达(15.63%,5/32)与结直肠癌组织中(65.63%,21/32)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。蛋白质印迹的验证结果与免疫组织化学结果一致。PRDX1蛋白的表达与患者的性别、年龄间无明显相关性(P>0.05),然而PRDX1蛋白的表达与Ⅲ期结直肠癌患者或者有淋巴结转移的患者之间有明显的相关性(P<0.05)。结论 PRDX1在结直肠癌组织中高表达,可能参与了肿瘤的进展,检测其表达情况在结直肠癌的诊治中可能具有一定的作用。

1例重度肥胖伴心力衰竭的结肠癌患者围术期管理

肥胖是体内脂肪,尤其是三酰甘油过度积聚而导致的一种营养失衡性疾病,越来越严重的威胁到人类健康,尤其严重肥胖伴有心肺功能不全时明显增加手术风险。本文报道1例重度肥胖伴心力衰竭的结肠癌患者围术期管理经验,以期对重度肥胖伴心力衰竭的癌症患者管理有所借鉴。

典型天气形势与溪洛渡电站发电供求关系的影响

本文利用2015—2017年溪洛渡电站逐日入库及出库流量、逐日电站出力资料、广东逐日用电负荷数据及NCEP逐日再分析资料,针对溪洛渡右岸电站汛期弃水严重、枯期水量不足,电站发电与广东用电需求存在矛盾的几种生产情景,划分为供不应求型、供过于求型和非典型供过于求型3种类型,选取典型个例分析不同类型对应的环流形势和天气成因,并提出今后溪洛渡电站调度的建议。结果表明:每年5、6月,广东常受副热带高压控制,用电需求较大,而宜宾以上流域大多受一致的偏西或西南暖湿气流控制,冷空气活动较弱,不利于产生大范围降水,使得溪洛渡电站发电能力与广东用电需求多呈供不应求型;7—9月,宜宾以上流域多受高原槽及切变线影响,有利于出现明显降水,电站具备满发能力,而华南一般有低涡切变或台风活动,有利于广东出现降水,由于不受副高控制且出现降水,广东用电需求降低,导致出现供过于求型;如广东在副热带高压控制之下,用电需求旺盛,但溪洛渡右岸具备满发能力而出现弃水的情景,往往是因为西南地区降水总体较强,其他水电站加大出力,而电网送出受限等多方面因素影响,导致电网对溪洛渡右岸的电能需求减少,即出现非典型供过于求型。在实际发电生产中可根据天气环流形势提前研判,更加有针对性地开展水库调度、优化电站运行,增加汛期水电电能的有效消纳以及水能资源充分利用。

公安机关户籍业务电子政务建设的主要障碍和有效对策

电子政务是地方政府努力提高行政能力的必然措施,同时也是保障人民的基本知情权的重要方式,因此进一步做好电子政务是地方政府向服务型政府迈进的必由之路。当前公安机关户籍业务电子政务建设取得突出成效,但是总体来看其进一步发展依然面临不少障碍。该文基于此指出了公安机关户籍业务电子政务建设的主要障碍,最后提出了公安机关户籍业务电子政务建设的有效对策。

缺氧诱导因子-1抵抗缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡

目的 通过对结肠癌SW480细胞中缺氧诱导因子-1（HIF-1）的有效干扰,观察沉默HIF-1后对肿瘤细胞缺氧环境下凋亡的影响.方法 以三气培养箱诱导缺氧环境,pGenesil-11 质粒为载体转染SW480细胞沉默HIF-1.透射电镜观测肿瘤细胞的形态学变化;荧光染料Hoechst 33258、DNA Ladder检测细胞凋亡.结果 与第3天（0.19±0.02）、第15天（0.20±0.03）比较,第7天（0.16±0.02）时RNA干扰效果最好（P〈0.05）.RNA阳性干扰组结肠癌SW480细胞：电镜下可见凋亡小体形成等形态学变化;细胞凋亡荧光检测,染色呈强蓝色荧光,并可见核碎裂;DNA Ladder检测出现细胞凋亡时典型的梯状条带.结论 HIF-1具有对抗缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡的作用.

RNA干扰SW480细胞HIF-1α双向凝胶电泳中横向拖尾的消除及条件的优化

目的建立RNA干扰结肠癌SW480细胞系,并对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)双向凝胶电泳中的多个关键步骤进行优化,以消除横向拖尾。方法以携带针对HIF-1α两条干扰片段的pGenesil-11质粒转染SW480细胞,沉默HIF-1α。对双向凝胶电泳中样品裂解液、样品的处理方式、上样量及电泳条件等进行优化。结果转染第7天RNA干扰效果最好。RNA干扰后,SW480细胞蛋白用含有硫脲的裂解液B进行提取,以样品制备方法A进行处理后,上样200μg蛋白,延长除盐时间,聚焦50000伏小时,得到的双向凝胶电泳图基本没有横向拖尾,分离蛋白点1288±15。结论已成功建立了RNA干扰结肠癌SW480细胞系;优化的双向凝胶电泳可有效消除横向拖尾,为进一步分析、鉴定和寻找与疾病相关的蛋白质奠定了基础。

急性阑尾炎相关评分的应用

急性阑尾炎是外科常见病，是最多见的急腹症之一。Fitz［1］在1886年首先正确地描述了本病的病史、临床表现和病理所见，并提出阑尾切除术是本病的合理治疗。此病的临床诊断主要依靠病史、临床症状、体检和实验室检查。1986年，Alvarado［2］通过对可疑阑尾炎患者的症状、体征及实验室检查进行回顾性的研究，建立了Alvarado评分，帮助临床医生筛查急性阑尾炎，这也是使用最广泛的急性阑尾炎评分系统。目前，B超、CT等技术的发展为急性阑尾炎的诊断提供了很大的帮助，绝大多数急性阑尾炎患者能够早期诊治、早期手术。但是，在低收入国家或不发达地区开展CT等辅助检查具有较大的困难，临床医生仍然在本病的诊断中时常遇到麻烦。因此，急性阑尾炎的评分系统仍然具有一定的应用价值。笔者就对急性阑尾炎评分在临床的应用情况及发展方向做一简要综述。

胃肠间质瘤患者的全程化信息化管理

胃肠间质瘤(GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤。随着对GIST诊疗的进步,患者生存期显著延长,疾病进入“慢性病”范畴。因此,如何对患者进行有效的全程化信息化管理是每一位GIST同仁面临的重要问题。我们认为:每一位GIST患者都有进行全程化管理的需求,这也是保障患者疗效的重要因素;信息化管理的理念、符合GIST疾病特点的管理系统以及专职的GIST疾病管理员,是实现全程化管理的保障,也是实现GIST诊治同质化的必备条件。

全腹腔镜下远端胃癌根治加三角吻合术后远期生存情况观察

目的观察比较全腹腔镜下远端胃癌根治加三角吻合术与腹腔镜辅助远端胃癌根治加管状吻合术后的生存情况。方法回顾性分析2012年12月至2015年3月间重庆医科大学附属第一医院胃肠外科行腹腔镜远端胃癌根治加毕I式吻合术的160例患者的临床病理资料，所有患者术前均经检查明确诊断为原发性胃癌，影像学检查未发现胃癌侵犯邻近器官、远处转移和重要血管周围融合肿大的淋巴结。根据不同手术组医师对掌握手术吻合方式的不同，对其中86例患者行全腹腔镜远端胃癌根治加三角吻合术（三角吻合组），74例患者行腹腔镜辅助远端胃癌根治加管状吻合术（管状吻合组）；患者均获知情同意并签署知情同意书。随访截至2015年10月，以随访终点计算期末累计生存率。比较两组患者的临床病理资料和期末累计生存率。结果两组患者基线资料具有可比性。所有患者手术过程顺利。三角吻合组随访7～32月，随访率91％（78／86），其中11例患者死于肿瘤复发或转移，期末累计生存率为82．8％；管状吻合组随访7～33月，随访率95％（70／74），其中7例患者死于肿瘤复发或转移，期末累计生存率81．7％；两组期末累计生存率的差异无统计学意义（χ2=1．210，P：0．271）。三角吻合组与管状吻合组的I期患者均无肿瘤所致的死亡病例，Ⅱ期患者的期末累计生存率分别为87．2％和93．3％（χ2=0．426，P=0．514），Ⅲ期患者的期末累计生存率分别为65．3％和37．6％（χ2=0．718，P=0．397），差异均无统计学意义。结论全腹腔镜下远端胃癌根治加三角吻合术与腹腔镜辅助远端胃癌根治加管状吻合术后患者生存情况相近。