miR-23a/27a/24基因簇g.65307469G>A突变对大白猪产仔数和启动子活性的影响

[目的]本文旨在研究大白猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点多态性与产仔数性状的关系及潜在机制,为母猪繁殖性状的分子育种提供新的潜在遗传标记。[方法]利用混池测序技术筛选猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点,直接测序法对大白猪群体(n=345)miR-23a/27a/24基因簇突变位点进行基因分型,计算遗传多样性;用线性模型对突变位点多态性与产仔数性状进行关联性分析;构建不同等位基因类型启动子载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过检测荧光素酶活性分析突变对启动子活性的影响;用生物信息学方法预测不同等位基因类型启动子潜在结合的差异转录因子,用荧光素酶活性分析差异转录因子对不同等位基因类型启动子活性的影响。[结果]在猪miR-23a/27a/24基因簇启动子-648 nt(Chr.2,65307469 nt)处发现1个新的G/A突变,命名为g.65307469G>A。在大白猪群体中发现3种基因型(GG、GA和AA),其中GG为优势基因型(89.57%),G等位基因为优势等位基因(94.64%)。关联性分析发现,GA基因型母猪的总产仔数(TNB)比GG基因型母猪每胎高0.56头(P<0.05)。荧光素酶活性分析结果显示G等位基因类型启动子活性显著高于A等位基因类型(P<0.05)。在不同等位基因类型启动子间发现1个潜在结合的差异转录因子死亡相关蛋白1(THAP1),成功构建猪THAP1基因过表达载体,共转试验结果显示转录因子THAP1对不同等位基因类型启动子活性均无显著影响(P>0.05)。[结论]miR-23a、miR-27a和miR-24是大白猪产仔数性状的候选基因,g.65307469G>A突变抑制miR-23a/27a/24基因簇的启动子活性,但与转录因子THAP1无关。

BRE-AS启动子负调控区变异与启动子活性、母猪繁殖力的关系

[目的]本试验旨在研究BRE反义lncRNA(BRE antisense lncRNA,BRE-AS)基因启动子负调控区(PNRR)序列特征,以及变异位点多态性与母猪繁殖性状、启动子活性的关系。[方法]采用DNA测序法获得大白猪BRE-AS基因PNRR序列;利用池DNA测序筛选大白猪BRE-AS基因PNRR上的变异位点,DNA测序法进行基因分型;利用GLM模型进行变异位点多态性、单倍型与母猪繁殖性状的关联分析;利用荧光素酶报告系统分析变异对BRE-AS基因启动子活性的影响。[结果]大白猪BRE-AS基因的PNRR位于-952~-161 nt,长度792 bp。在大白猪BRE-AS基因PNRR的-794和-756 nt处发现了2个变异位点,分别将其命名为g.-794T>G和g.-756A>C。在大白猪群体中BRE-AS基因g.-794T>G位点有3种基因型,其中TT型为优势基因型(0.752),T为优势等位基因(0.863);在g.-756A>C位点有3种基因型,其中AA型为优势基因型(0.759),A为优势等位基因(0.868);2个变异位点形成3种合并基因型,其中TT/AA型为优势基因型(0.760),T-A为优势单倍型(0.869)。关联分析发现2个位点及其合并基因型均与母猪总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)和健仔数(NSP)等3个繁殖性状间显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)关联。荧光素酶活性分析发现G-C单倍型启动子活性极显著高于T-A单倍型(P<0.01)。[结论]BRE-AS是大白猪繁殖性状的候选基因,其PNRR上2个变异位点(g.-794T>G和g.-756A>C)通过影响启动子活性影响其母猪繁殖力。

不同冻存时间对猪肌内脂肪含量及其与生产性状相关性的影响

[目的]本文旨在探究不同冷冻时间对猪肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的影响并分析IMF含量和其他生产性状的相关性。[方法]从299头杜洛克×(长白×大白)三元商品猪群中随机挑选52头作为试验对象,测定屠宰前活体重、屠宰后胴体重以及相关肉质性状;采集倒数第3~4肋骨间的背最长肌,采用索氏抽提法分别测定0 d鲜肉样、-80℃超低温冻存90和180 d肉样的IMF含量。对3个不同时间点测定的IMF含量进行相关性与差异显著性分析,并对3个不同时间点的IMF含量与测定的生产性状的相关性进行比较分析。[结果]0 d与冻存90 d的IMF含量呈极极显著相关(r=0.75),2个时间点测定的平均IMF含量不存在显著差异(P>0.05),但与0 d相比,冻存90 d的平均IMF含量呈上升趋势;0 d与冻存180 d的IMF含量呈显著相关(r=0.29),但与0 d相比,冻存180 d测定的平均IMF含量极显著升高(P<0.01)。性状相关分析结果显示,0 d和90 d的IMF含量与屠宰前活体重和胴体重呈极极显著相关(P<0.001),而180 d的IMF含量仅与胴体重呈极极显著相关(P<0.001),而且不同冻存时间对IMF含量与肉质性状的相关性产生不同程度的影响。[结论]肉样在-80℃冻存会增加IMF含量,但冻存90 d对IMF含量不会产生显著影响,而冻存180 d会极显著影响IMF含量。另外,低温冷冻对测定的IMF含量与生产性状的相关性产生不同程度的影响。本研究结果可为屠宰后肌肉块IMF含量测定的标准化以及行业标准的制定提供有价值的参考。

利用Cas9/sgRNA体系提高猪胎儿成纤维细胞基因组编辑效率

[目的]本文旨在利用Cas9/sgRNA体系,提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区(包含第一外显子区)设计2条sgRNA,将其构建在PX459-cas9-puro质粒上,以获得PX459-cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同原间隔序列(protospacer-adjacent motif,PAM)构建在RGS-CR质粒上,以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染,筛选打靶效率较高的一条sgRNA,并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞(PEF)进行后续基因打靶试验。分别使用PX459-cas9-sgRNA质粒和Cas9/sgRNA 2种方法对PEF的靶位点进行基因敲除,将转染后的细胞提取基因组DNA,以桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-cas9-sgRNA质粒和含PAM序列的RGS-sgRNA,质粒测序结果显示序列插入正确;RGS-sgRNA筛选结果表明,sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1(P<0.01),且sgRNA2无脱靶效应,因此后续使用PX459-cas9-sgRNA2和Cas9/sgRNA2在PEF中进行基因打靶试验,并比较两者的基因打靶效率。在猪胎儿成纤维中,PX459-cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为15.67%,Cas9/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%。[结论]Cas9/sgRNA体系较PX459-cas9-sgRNA质粒打靶效率提高了约1倍,这对提高猪体细胞的基因编辑效率和促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。

高通量技术挖掘猪microRNA的研究进展

microRNA(miRNA)是一类功能强大的小RNA分子,大量的研究表明miRNA在生物的各种生命活动中发挥着重要的作用。本文首先对miRNA的发现、生成与作用机制进行了简单的阐述,并对测序技术的发展历史与新一代测序技术的出现进行了回顾;之后重点对高通量miRNA芯片技术与深度测序技术在猪miRNA研究中的应用进行了综述,并对未来miRNA的研究重点进行了展望。

粪肠球菌替代抗生素对保育仔猪生长性能、腹泻率、体液免疫指标和肠道微生物数量的影响

为研究粪肠球菌替代饲用抗生素的可行性,将150头25日龄断奶仔猪[（8.41±0.17）kg,杜×长×大],随机分为基础日粮、100 g·t^-1粪肠球菌（处理Ⅰ组）、200 g·t^-1粪肠球菌（处理Ⅱ组）、400 g·t^-1粪肠球菌（处理Ⅲ组）和抗生素组共5组,每组4个重复,每个重复7或8头仔猪。试验1～14 d和15～28 d测定各组猪只生长性能和腹泻率;试验开始和结束时测定基础日粮组、抗生素组和处理Ⅱ组血清IgA、IgM、IgG含量,同时试验结束时测定上述3组肠道微生物数量。结果表明：1～14 d阶段,各处理组平均日增重、料肉比和腹泻率较基础日粮组均显著改善（P〈0.05）,且与抗生素组差异不显著（P〉0.05）,其中以处理Ⅱ组最佳;15～28 d阶段。仅处理Ⅱ组较基础日粮组平均日采食量显著提高（P〈0.05）,较抗生素组相比无显著变化（P〉0.05）。试验结束时,处理Ⅱ组血清IgG含量较基础日粮组显著升高（P〈0.05）,血清IgA含量有升高趋势（P=0.084）,但均与抗生素组无显著差异（P〉0.05）,同时处理Ⅱ组空肠中大肠杆菌数量较基础日粮组也显著降低（P〈0.05）。结论：添加200 g·t^-1的粪肠球菌能显著改善试验仔猪保育前期平均日增重、料肉比、腹泻率和保育后期的平均日采食量,并能够增强体液免疫性能,降低空肠大肠杆菌数量。

骨骼肌肌纤维形成机制的研究进展

骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分,占到产肉动物躯体的40%,肌纤维作为骨骼肌组织的主要成分,其类型的差异是影响产肉动物肌肉品质的重要因素之一。因此,骨骼肌的生长发育与产肉动物肉的产量有着密切的联系,而其生理生化特性的差异也将会直接影响到产肉动物屠宰之后肉品的质量。一般而言,动物骨骼肌肌纤维数目在胚胎发育期间基本上就已固定,出生之后,由于肌纤维的肥大,动物躯体肌肉块才表现出增大增粗。另外,动物肌肉块在生长发育过程中,其肌纤维组成类型并不是完全固定的,它们会随着骨骼肌对代谢与功能需求的改变而发生转变。骨骼肌的生长发育,以及骨骼肌肌纤维类型的发生与发展是一个非常复杂的生物学过程,受到许多信号通路与因子的调控。随着分子生物学技术的飞速发展,各种先进技术相继被应用于生物学现象的研究中,利用这些分子生物学技术很好的阐明了许多复杂生物学现象形成的分子机制。目前,骨骼肌生长发育的分子遗传调控机制取得了长足的进展,许多与骨骼肌形成发育相关的关键因子已被鉴定出来。然而,在早期研究中,人们对于骨骼肌肌纤维的研究主要集中在类型的鉴定,以及不同肌纤维类型生理生化特性的分析,对于骨骼肌肌纤维形成的具体分子遗传调控机制的研究相对较少。近年来,随着研究的不断深入,骨骼肌肌纤维形成的分子遗传调控机制也取得了突破性的进展。因此,有必要进一步对骨骼肌肌纤维类型的特性,骨骼肌肌纤维类型形成的分子机制,以及肌纤维类型与肌肉品质的关系进行全面的综述。本文首先对肌纤维的类型、特性进行了综述;进一步分别对慢型肌纤维与快型肌纤维形成的分子调控机制的研究进展进行了回顾;最后对肌纤维类型与肉品质的关系进行了讨论。总之,本综述的撰写将有助于对骨骼肌肌纤维类型形成的遗传机制的进一步了解,为将来进一步的深入研究肌纤维形成的分子机制提供参考;同时也将有助于揭示肌肉品质形成的分子遗传调控机制,为利用分子生物学技术培育高品质新品种或新品系产肉动物提供分子理论依据。

鸡HSP90AA1基因SNP检测及启动子区CpG岛的甲基化研究

试验旨在获得鸡热休克蛋白90α(HSP90AA1)基因序列并分析其基因结构和相关遗传变异,检测HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化状态,初步探索HSP90AA1基因在肌肉组织生长发育中的作用。以文昌鸡和北京油鸡为试验材料,利用PCR扩增鸡HSP90AA1基因组序列;通过基因测序寻找该基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点;使用在线软件MethPrimer预测鸡HSP90AA1基因中CpG岛的位置;应用MassArray质谱法检测鸡胸肌中HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化水平,比较分析文昌鸡和北京油鸡HSP90AA1基因的甲基化差异。结果显示,在鸡HSP90AA1基因组中共发现7个SNPs位点,分别位于启动子区(A-189G,C-109T)、第1外显子(A+6G)、第2外显子(C+343T)、第2内含子(A+634G、A+836G)和第7内含子(A+3449G);鸡HSP90AA1基因包含10个外显子和9个内含子,其启动子区存在1个CpG岛,位于-1 802～-469bp处;在HSP90AA1基因启动子区共检测了42个CpG位点的甲基化水平,文昌鸡和北京油鸡中分别有9个(CpG_16.17.18、CpG_21.22.23、CpG_32.33和CpG_57)和4个CpG位点(CpG_1、CpG_5.6和CpG_57)在胸肌生长发育过程中发生甲基化改变。结果表明,文昌鸡与北京油鸡HSP90AA1基因序列信息和启动子区CpG岛的甲基化水平不同,这可能导致两种鸡对于应激反应具有不同的耐受程度。以上试验结果将为文昌鸡和北京油鸡生长发育规律、系统选育等方面的研究提供表观遗传学依据。

部分地方品种猪体尺、胴体及肉质性状分析

为进一步了解分析我国地方猪种的生长及胴体肉质性能,本试验对8月龄左右的沙乌头猪、沙乌头与杜洛克杂交一代猪、米猪和巴马香猪的体尺(不含巴马香猪)、胴体及肉质性状进行了测定。结果发现,米猪体重、体高、体长、胸围和腹围等指标均最大,分别为86.65 kg、63.25 cm、118.75 cm、107.25 cm、131.00 cm,其中体重、体高和腹围均极显著高于沙乌头猪(P<0.01),体长和胸围显著高于沙乌头猪(P<0.05),具有较好的体尺性能;巴马香猪肉色L、a、b值较大,分别为45.45、12.37、12.39,L、a值极显著高于米猪(P<0.01),b值显著高于米猪(P<0.05),具有较为优质的肉色;沙乌头猪肉色、pH1、嫩度、熟肉率等肉质综合指标在三个猪种中最佳。此外,三个品种其他指标如胴体瘦肉率、背膘厚、肌内脂肪、系水力等,均符合我国地方猪种普遍的胴体及肉质特性。

海南地方猪内源性反转录病毒的检测分析

为了解猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)在海南地方猪种五指山猪和海南猪基因组中的存在状况。试验利用猪内源性反转录病毒特异性引物对这两种猪的基因组进行PCR检测。结果显示:PERV普遍存在于海南地方猪基因组中,其中在五指山猪中PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别是100%、100%、20.69%;在海南猪中PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别是100%、100%、25.49%。该研究为海南地方猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。

两种猪肌内脂肪含量测定方法的比较及其与胴体和肉质性状的相关性分析

[目的]比较分析甲醇-氯仿法(JL法)和索氏抽提法(SS法)提取肌内脂肪的效果,研究猪肌内脂肪含量与胴体质量、背膘厚、嫩度的相关与回归关系。[方法]屠宰测定了279头四元(皮杜长大)商品猪的胴体质量、背膘厚和肉嫩度,并利用索氏抽提法测定肌内脂肪含量,对肌内脂肪含量与其他性状指标进行相关性、回归及通径分析。随机挑选92份肉样,采用甲醇-氯仿法重新测定肌内脂肪含量,并与相应样本的索氏抽提法所得数据进行相关性与差异显著性分析。[结果]索氏抽提法测得的肌内脂肪湿含量和干含量之间极显著相关(r=0.996,P<0.01);甲醇-氯仿法和索氏抽提法测得的肌内脂肪湿含量之间也极显著相关(r=0.909,P<0.01),但索氏抽提法测得的肌内脂肪含量极显著高于甲醇-氯仿法(P<0.01)。相关性分析结果显示,肌内脂肪含量与胴体质量、背膘厚及嫩度均存在极显著相关性(P<0.01),背膘厚与胴体质量也存在极显著相关性(r=0.629,P<0.01),但肌肉嫩度与胴体质量、背膘厚无显著相关性(P>0.05)。回归分析结果表明:背膘厚和肉嫩度与肌内脂肪含量存在极显著的回归关系(P<0.01),而胴体质量与肌内脂肪含量不存在显著的回归关系(P>0.05)。[结论]索氏抽提法和甲醇-氯仿法均可作为有效测定肌内脂肪含量的方法,但在比较品种或个体间肌内脂肪含量差异时,需要使用同一种测定方法获得的数据;肌内脂肪含量与背膘厚、嫩度均存在显著相关和回归关系。

过氧化氢诱导猪卵巢颗粒细胞自噬及其对凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·L^(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响;Western-blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3,包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/SQSTM1的表达量变化,转染GFP-LC3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)提前4 h抑制自噬后再氧化应激12 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,CCK8检测细胞活力。[结果]氧化应激12 h后,细胞活力随过氧化氢浓度提高显著降低,凋亡率显著上升。在氧化应激前6 h LC3-Ⅱ相对表达量先增加后减少,P62的相对表达量先减少再增加;转染GFP-LC3质粒后,自噬体数量极显著上调,6 h后显著下降,上述结果表明在氧化应激早期自噬增加,持续氧化应激自噬受到抑制。若提前4 h用3-MA抑制自噬,再用过氧化氢处理12 h,抑制自噬后细胞凋亡率较单独氧化应激组显著下降,细胞活力也显著上升。[结论]氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡和早期自噬,若抑制早期自噬,凋亡率会下降。

猪ATF4基因多态性与生产性状的关联及基因表达分析

为进一步了解和认识ATF4基因的功能,揭示ATF4对猪脂肪代谢的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用PCR方法扩增了ATF4基因部分序列,通过序列比对发现在翻译起始密码子ATG下游159 bp处存在A159G转换,通过PCR-AluⅠ-RFLP对大白猪、长白猪、梅山猪和通城猪进行酶切分型,发现在大白猪和长白猪中均为AA基因型,在梅山猪和通城猪中均为GG基因型。进一步对大白猪×梅山F2群体资源家系进行了酶切分型,并分析该位点的多态性与生产性状的关系。结果表明,ATF4的多态性与臀部平均膘厚存在极显著相关(P<0.01),与胸腰椎间膘厚、平均膘厚、眼肌高、眼肌面积存在显著相关(P<0.05)。采用Real-time PCR分析了ATF4基因在大白猪与梅山猪背最长肌不同发育阶段的表达模式。结果表明,ATF4基因在大白猪和梅山猪胚胎期65 d和出生后3 d中的表达水平相对都比较低,且在两品种间无明显差异;而在出生后60 d和120 d,ATF4基因在大白猪中与梅山猪均出现了上调表达,并且在梅山猪中的相对表达水平要显著高于大白猪。研究结果为进一步深入研究猪ATF4基因在脂肪代谢中的分子机理奠定了基础。

抑制素α亚基基因5'UTR区在苏淮猪中的多态性分析

[目的]探究抑制素α亚基基因(INHA)5'UTR区多态性与苏淮猪产仔数相关性,为苏淮猪的分子选育工作提供理论依据。[方法]选取189头健康苏淮母猪,通过PCR扩增和测序对INHA基因5'UTR区基因多态性进行了检测,同时利用生物信息学方法分析该序列特征,最后通过群体遗传学和生物信息学分析了不同基因型对苏淮猪产仔数的影响。[结果]在苏淮猪INHA基因5'UTR调控区-42G>A处发现一个SNP位点,对其进行多态性分析,存在3种基因型,分别为GG、GA、AA,且基因型分布不符合哈代温伯格定律(P<0.01)。G等位基因为优势等位基因,GG型为优势基因型,GG型苏淮猪的平均总产仔数比AA型多0.63头(P<0.05)。[结论]INHA基因5'UTR区多态性可用于苏淮猪繁殖性状的分子标记辅助选择,加速育种进程。

不同处理小鼠卵巢组织中HIF1α基因的表达分析及其真核表达载体构建

为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P<0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。

CIDEA基因上游调控区变异对猪肌内脂肪性状的影响

[目的]本文旨在鉴定诱导细胞死亡DNA片段化因子α样效应因子A(CIDEA)基因上游调控区内与猪肌内脂肪沉积相关的单核苷酸多态性(SNP)位点,并分析关联位点对基因表达的影响,为解析CIDEA基因对猪肌内脂肪性状的影响机制提供参考。[方法]通过对猪CIDEA上游调控区2 kb片段测序,挖掘出肌内脂肪含量相关的候选SNP位点,在杜洛克×长白猪×大白猪群体中对候选位点进行关联分析;通过荧光定量PCR检测关联位点不同基因型个体的CIDEA基因表达量和肌内脂肪标记基因脂肪酸结合蛋白4基因(FABP4)、脂肪酸结合蛋白3基因(FABP3)的表达量;双荧光素酶报告基因系统分析突变位点对CIDEA基因转录活性的影响。[结果]猪CIDEA基因上游调控区包含6个SNP位点,连锁分析后选择g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T 3个标签SNP位点进行关联分析,发现g.97268816 T>A位点中AA基因型个体的肌内脂肪含量显著高于TT基因型个体(P<0.05),而g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位点中3种基因型个体之间的肌内脂肪含量差异不显著(P>0.05)。g.97268816 T>A位点中AA基因型个体的CIDEA基因表达水平显著高于TT基因型个体(P<0.05),而FABP4基因表达水平则显著高于TT基因型个体(P<0.01)和TA基因型个体(P<0.05)。双荧光素酶报告基因活性的结果显示AA型个体的荧光素酶活性极显著高于TT型个体(P<0.01)。[结论]CIDEA基因上游调控区g.97268816 T>A位点与猪的肌内脂肪含量显著相关,突变可以导致CIDEA基因的表达水平升高,进而影响猪的肌内脂肪含量。

猪PRDX6基因编码区的多态性及遗传效应分析

PRDX6基因属于抗氧化蛋白超家族,主要在应答氧化压力、脂分解代谢、磷脂分解代谢中发挥作用。根据PRDX6基因的生理生化功能,文章选择其为影响猪肉质性状的候选基因,探索PRDX6基因的多态性与猪肉质性状的关系。首先分离了猪PRDX6的部分编码区序列,并在不同猪种间进行序列比对,发现编码区第4外显子有2个潜在的SNPs分别位于第417 bp处(C/T突变)和第423 bp处(A/G突变),但均没有引起氨基酸的改变。采用Pyrosequencing焦磷酸测序方法对这两个位点在6个猪种和247头F2"大白×梅山"资源家系中进行了遗传变异分析和性状关联分析。结果表明:417C/T位点国外品种均以C等位基因为主,而国内品种均以T等位基因为主,该位点与肌内脂肪、肌肉水分存在显著关联(P<0.05);423A/G位点国外品种均以A等位基因为主,国内品种以G等位基因为主,该位点与失水率、系水力、肌内脂肪及肌肉水分存在显著关联(P<0.05)。由此推断:这两个位点很可能是影响猪肉质性状(尤其是肌肉嫩度)的分子标记。

TGF-β1基因g.8666_8667delAC位点突变与大白猪繁殖性能的关系

[目的]本文旨在了解大白猪转化生长因子β1(TGF-β1)基因第4内含子序列特征,分析其突变位点多态性与繁殖性能的关系及潜在机制。[方法]利用PCR扩增和测序技术获得大白猪TGF-β1基因第4内含子序列,用生物信息学软件分析序列特征;利用DNA混池测序技术筛选目标序列突变位点,用直接测序法进行基因分型,用SAS软件对突变位点多态性与繁殖性能进行关联性分析;利用克隆测序技术测定不同基因型个体卵巢颗粒细胞中TGF-β1基因编码区序列,分析突变对mRNA剪接的影响。[结果]大白猪TGF-β1基因第4内含子序列全长189 bp,含有1个微卫星(GT)_(6)和多个顺式作用元件结合位点,与杜洛克猪相应序列的一致性为98.94%。在第4内含子63~64核苷酸处(TGF-β1基因的8666~8667核苷酸处)发现一个2 bp序列的插入/缺失突变,命名为g.8666_8667delAC。在大白猪群体中发现3种基因型(ins/ins、ins/del和del/del),其中ins/ins为优势基因型(57.8%)。关联性分析发现,ins/del基因型母猪的初产死胎数(NSB)显著高于另2种基因型(P<0.05);del/del基因型母猪的总产仔数(TNB)比ins/ins基因型和ins/del基因型分别高0.47和0.46头(P>0.05)。克隆并测序后发现ins/ins基因型和ins/del基因型母猪卵巢颗粒细胞中TGF-β1基因编码区序列长度一致。[结论]TGF-β1基因是大白猪繁殖性状的候选基因,g.8666_8667delAC位点del/del基因型是总产仔数(TNB)的有利基因型,ins/del基因型母猪初产死胎数(NSB)较高;g.8666_8667delAC位点突变不是通过影响TGF-β1基因的选择性剪接来影响繁殖性能。

猪ATF4基因真核超表达载体的构建及鉴定

克隆猪ATF4基因CDS,构建pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,为下一步在细胞水平和个体水平研究该基因功能奠定基础。提取RNA,运用RT-PCR和巢式PCR技术扩增猪ATF4全部编码序列,克隆转化到pMD18-T载体中,测序验证后,酶切连接到pcDNA3.1(+)载体中,构建成pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,对其进行酶切和测序鉴定并在细胞水平上进行表达量的鉴定。实验结果表明,在转染了pcDNA3.1(+)-ATF4载体的细胞中,ATF4 mRNA表达水平明显增加,成功构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

促肾上腺皮质激素对母猪肝中葡萄糖代谢相关酶转录表达及活性的影响

旨在研究促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)对母猪肝中葡萄糖代谢相关酶转录表达及活性的影响,以探讨应激状态下肝调节血糖水平的分子机制。本研究选取9头健康经产断奶苏淮母猪,随机分成处理组(5头)和对照组(4头)。对处理组母猪注射外源ACTH,对照组母猪注射生理盐水;每天处理3次,连续7d。试验期间每天采集母猪血液;试验结束后,取母猪肝组织。利用放射免疫分析方法测定血液皮质醇浓度,利用生化分析仪测定血糖浓度,通过荧光定量PCR检测葡萄糖代谢相关酶和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的转录表达,利用分光光度法检测葡萄糖代谢相关酶的酶活性。结果表明,ACTH处理组母猪血液中皮质醇及葡萄糖水平均显著高于对照组(P<0.05)。ACTH处理对母猪肝中丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(PCK2)、磷酸果糖激酶(PFKL)、丙酮酸激酶(PKLR)、己糖激酶1(HK1)、己糖激酶3(HK3)、糖原合成酶1(GYS1)、糖原磷酸化酶(PYGL)及6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)的mRNA表达无显著影响(P>0.05)。ACTH处理显著上调母猪肝中葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)和己糖激酶2(HK2)的mRNA表达水平(P<0.05)。此外,ACTH处理显著上调母猪肝中葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的酶活性(P<0.05),显著下调磷酸果糖激酶(PFKL)的酶活性(P<0.05)。与对照组相比,ACTH处理组GR mRNA表达水平呈上调趋势,但组间差异不显著(P>0.05)。结果提示,ACTH处理上调母猪血糖水平,不仅通过促进肝中糖异生关键酶G6PC、PCK1和HK2的转录表达及增强G6PC的活性增加糖异生反应,还通过降低糖酵解关键酶PFKL的活性抑制糖酵解反应。此外,ACTH处理未影响肝中GR的转录表达。