甘蔗抗褐锈病Bru1区域的鉴定及候选抗病基因的功能分析

【目的】甘蔗褐锈病是由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H. Sydow&P. Sydow)引起的最具破坏性的真菌病害之一,能造成蔗糖分降低10%—36%,严重威胁甘蔗产业发展。已有研究揭示抗褐锈病主效基因定位于Bru1区域,克隆其关键候选基因,并进行功能研究,为选育抗褐锈病甘蔗新品种提供重要的候选基因资源。【方法】利用PacBio SequelⅡ测序平台获得甘蔗栽培品种ROC22的contig水平基因组信息,鉴定到抗褐锈病Bru1区域,对其进行基因注释和克隆,分析其组织特异性和抗、感褐锈病甘蔗品种中的表达模式及其在烟草叶片的亚细胞定位和瞬时表达。【结果】基于Bru1位点区域紧密连锁的标记R12H16和9O20-F4,从该区域中注释到33个基因,结合典型抗病基因结构域,共筛选获得5个候选抗病基因,分别为Brrg99、Brrg103、Brrg108、Brrg115和Brrg116。以甘蔗栽培品种ROC22的cDNA为模板,克隆获得Brrg116的全长序列729 bp,编码242个氨基酸残基。将该基因序列分别比对甘蔗热带种和割手密种及二倍体近缘种高粱的基因组数据库,发现其与热带种和割手密种的同源基因序列相似性很高,达到98%以上,而与高粱的相似性为93.77%。系统进化树揭示该基因起源甘蔗割手密种。实时荧光定量PCR检测表明,Brrg116在甘蔗栽培品种的多个组织中组成型表达,尤其是在+1叶中的表达量最高,是蔗芽的9.8倍;在褐锈病菌侵染抗、感甘蔗栽培品种的6和72 h时,呈现显著差异表达。亚细胞定位结果显示,该基因编码蛋白定位于细胞膜上。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时过表达Brrg116,其后接种茄病镰刀菌蓝色变种,二氨基联苯胺法(3,3′-diaminobenzidine,DAB)染色逐渐加深,超敏反应相关基因、水杨酸信号和乙烯信号途径中的相关基因持续上调表达。【结论】Brrg116在甘蔗不同组织中组成型表达,且在受褐锈病菌侵染的抗病甘蔗栽培品种中呈现快速的诱导表达。此外,过表达Brrg116引发水杨酸和乙烯等激素信号通路产生防御响应,推测该基因可能在提高植物的抗病性方面发挥重要调控作用。

甘蔗Ca^(2+)/H^+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca^(2+)/H^+antiporter)是植物细胞膜Ca^(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。

甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因的克隆与表达分析

以水稻A BA99594序列为探针,使用电子克隆技术,获得甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因(Diaminopimelate epimerase,DAPE)的1条cDNA全长序列,命名为ScDAPE。经RT-PCR扩增和序列分析验证后,该基因序列与电子克隆结果一致,基因全长1 168 bp,包含1个816 bp的开放阅读框,编码271个氨基酸残基,生物信息学分析预测该基因编码蛋白定位于内质网膜,为可溶性酸性蛋白,无信号肽,二级结构元件多为无规卷曲,含有2个保守功能域,主要功能为氨基酸合成。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗侧芽、花序、叶片和顶端分生组织中均有表达,花序中的表达量最高,且该基因的表达受温度调控。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗根、蔗髓、蔗皮、侧芽、叶片、叶鞘中均有表达,且在根中的表达量最高。此外,该基因的表达受水杨酸(salicylic acid,SA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、模拟干旱(PEG)、高盐(NaCl)和氯化镉(cadmium chloride,CdCl2)的胁迫诱导,其中受水杨酸胁迫后表达量最高,约为对照组的12.4倍,其次为聚乙二醇,约为对照组的2.72倍,推测该基因的表达与甘蔗抗病性和抗渗透胁迫有关。研究结果为甘蔗中不同DAPE基因的克隆和功能验证以及甘蔗ScDAPE基因在甘蔗基因工程中的应用奠定了一定的基础。

与甘蔗抗黑穗病性相关的14-3-3基因的克隆和表达分析

为了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用,本研究以课题组前期构建的甘蔗抗黑穗病抑制消减杂交文库中筛选出的1个与14-3-3基因同源的EST序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR方法从甘蔗ROC22品种中分离到1个Sc14-3-3基因(Gen Bank Accession Number:KJ577592),并对其序列信息和基因表达情况进行分析。结果显示,该基因ORF长771 bp,编码256个氨基酸残基;Sc14-3-3是定位于细胞质的亲水蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,有10个Ser、3个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,并在N-端有4个蛋白结合区和1个多核苷酸结合区,对翻译和能量新陈代谢起着重要作用;该蛋白属非ε类群,其N-端和中间区域在不同物种间相对保守,C-端差异相对较大。基因表达模式分析显示,Sc14-3-3基因可能参与甘蔗对生物逆境的细胞免疫响应,其对Me JA介导的信号途径应答较SA和ABA早;黑穗病菌胁迫下,Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品种中的表达模式存在差异,其在抗黑穗病品种YC05-179中上调表达且表达量变化明显,揭示了该基因参与甘蔗对黑穗病的应答反应。以上结果为甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究积累了一定的基础资料,并为今后甘蔗的抗病分子育种提供后备基因资源。

基于田间表型和Bru1基因检测分析甘蔗褐锈病抗性遗传

由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala)引起的甘蔗褐锈病具有产孢量大、流行性强的特点,可导致甘蔗产量和蔗糖分的严重损失,了解抗病性遗传有助于抗锈病育种中的亲本选择和组合配制,而有效的抗性鉴定技术则是分离个体选择所必需的。本研究以甘蔗分离群体为材料,利用表型与抗褐锈病主效基因Bru1检测相结合,研究甘蔗褐锈病抗性遗传倾向并评价Bru1基因检测与表型抗性的关联性。结果显示,发病盛期,感病个体中,Bru1基因未检出率为96.7%,但未感病个体中,Bru1基因的检出率仅为66.0%,且高抗组合CP84-1198×云蔗89-7群体中的未感病个体,该基因检出率为0,尽管也发现有2个组合的未感病个体中,该基因的检出率为100%。说明由Bru1基因控制的抗性可根据该基因的检测结果判断其抗/感病性,同时,甘蔗基因池中还存在其他未知的控制抗病性状的主效基因。值得强调的是,父母本的抗病性均影响杂交后代的抗病性,但以抗病亲本为父本的组合,其分离群体的感病个体明显减少,说明父本对杂交后代的褐锈病抗性影响可能更大。

甘蔗SCoT-PCR反应体系优化与多态性引物筛选及应用

目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种新型的标记,结合了ISSR标记和RAPD标记的优点.本研究针对SCoT-PCR反应体系的影响因素,以甘蔗叶片DNA为材料,在单因子实验的基础上,采用L16(45)正交实验设计,进一步探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶等5个因素对甘蔗SCoT-PCR扩增效果的影响,建立了甘蔗SCoT-PCR的优化反应体系.25μL PCR反应混合液中,含50 ng DNA模板、2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、0.625 U Ex Taq酶,dNTP和引物的终浓度分别为0.22 mmol/L和0.9μmol/L.以我国种植面积最大的栽培品种新台糖22号为模板,应用优化体系,对40条SCoT标记引物进行测试,筛选出16条有效扩增的引物,且均为多态性引物,其GC含量在50%～67%之间.该体系的稳定性和SCoT标记引物的扩增能力,通过基于随机选择的4条引物对9份具有地理来源和遗传背景不同的甘蔗种质进行标记分析来验证,结果共扩增出84条带,其中多态性条带占82.14%,平均单条引物可扩增出21条.研究结果为在甘蔗上进一步开发和应用功能性SCoT标记奠定了基础.

甘蔗乙醇脱氢酶基因的克隆与表达

乙醇脱氢酶基因(Alcohol dehydrogenase,ADH)在植物抵御涝害、冷害、干旱等逆境中起着重要作用.基于前期已构建的甘蔗受黑穗病菌胁迫后基因差异表达的抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)文库,利用电子克隆和RT-PCR技术,从甘蔗品种ROC22中获得一条ADH基因的c DNA全长序列,命名为Sugarcane Alcohol Dehydrogenase(Sc ADH;Gen Bank登录号为KJ577593).生物信息学分析显示,Sc ADH基因全长为1 644 bp,含有1 140bp的开放阅读框,编码一个379个氨基酸的蛋白质.Sc ADH蛋白为稳定、亲水的酸性非分泌蛋白,定位于叶绿体基质上.蛋白二级结构元件多为无规则卷曲,具有典型的ADH蛋白结构域以及NAD和锌的结合位点.实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)表达分析表明,该基因在甘蔗各组织中组成型表达,其中根中表达量最高,而叶中的表达量最低.在SA和Me JA胁迫下,Sc ADH基因的表达趋势为"先扬后抑",均在胁迫6 h达到最大值,分别为对照的7.34倍和11.81倍.在ABA胁迫下,该基因均上调表达,在胁迫12 h达到最大值,为对照的5.53倍.在黑穗病菌胁迫下,该基因在感病品种ROC22中的表达受到抑制,而在抗病品种YC05-179中的表达模式为"先抑后扬".综上推测Sc ADH基因在甘蔗应答非生物胁迫和生物胁迫中发挥重要作用.

甘蔗真核生物翻译起始因子5A基因的克隆与表达分析

真核生物翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,e IF5A)是一种在动植物和真菌体内普遍存在的蛋白质.为了解e IF5A基因在甘蔗应答生物逆境胁迫中的作用,本研究首先从黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)文库中获得一条与玉米e IF5A基因(Gen Bank Accession Num ber:EU958725.1)同源性为93%的甘蔗EST序列;其次,以此序列作为探针,通过电子克隆技术获得一条甘蔗e IF5A基因的c DNA拼接序列;最后,经RT-PCR扩增和测序验证,结果显示电子克隆序列与测序序列一致,将该序列命名为Sce IF5A(Gen Bank Acce ssion Number:KJ577595).生物信息学分析显示,Sce IF5A基因c DNA全长1 174 bp,含有长度为483 bp、编码160个氨基酸的完整开放读码框;Sce IF5A蛋白是酸性稳定蛋白,分子量(Mr)为17 453.6,含有12个保守氨基酸序列,推测定位于细胞质.实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析结果表明,在黑穗病菌、水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸胁迫下,Sce IF5A均上调表达,推测Sce IF5A基因在甘蔗响应黑穗病菌侵染过程中被诱导表达,且其表达受内源激素信号通路的调控.本研究获得的Sce IF5A基因的结构特征和功能作用模式为研究该基因在甘蔗与黑穗病菌互作中的作用积累了基础数据.

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅣ1的克隆、序列分析及其表达

几丁质酶(Chitinase,EC 3.2.2.14)参与植物的生长发育及防卫反应。本研究借助电子克隆技术,以甘蔗(Saccharum spp.)抗黑穗病基因型崖城05-179针刺接种黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)48 h的蔗芽c DNA为实验材料,克隆获得一个甘蔗几丁质酶c DNA序列(Gen Bank登录号:KP165001),命名为Sc ChiⅣ1。生物信息学分析结果显示,该核苷酸序列全长为1 037 bp,包含1个长为825 bp的完整开放读码框,编码274个氨基酸,理论等电点为8.29。该基因推导的编码蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,含信号肽和几丁质结合区,胞外定位的概率为0.820,推测Sc ChiⅣ1是一种胞外分泌蛋白,同时兼具溶菌酶活性。聚类结果显示,Sc ChiⅣ1归属于ClassⅣ几丁质酶基因。荧光定量PCR分析显示,甘蔗接种黑穗病菌后的96 h内,抗、感基因型中Sc ChiⅣ1表达量均高于对照,且在亲和互作中Sc ChiⅣ1转录本上升应答快(6 h),并在接种黑穗病菌后96 h持续更长,其在甘蔗不同黑穗病抗/感基因型材料(崖城05-179/柳城03-182)与黑穗病菌互作中的表达模式存在差异,但总体结果表明Sc ChiⅣ1受黑穗病菌胁迫诱导表达。本研究为后续甘蔗几丁质酶功能鉴定及甘蔗抗黑穗病基因工程研究奠定基础。