北美鹅掌楸LtuHMGS基因的克隆与生物信息学分析

【目的】研究北美鹅掌楸LtuHMGS基因的结构特性、亚细胞定位及表达模式,为从分子水平探究北美鹅掌楸萜类合成途径提供理论基础。【方法】从北美鹅掌楸转录组数据库中鉴定出一条HMGS基因序列,采用RACE技术克隆其全长cDNA,将其命名为LtuHMGS。对LtuHMGS基因的ORF进行生物信息学分析,探究其理化性质及与同源基因的系统进化关系;利用烟草瞬时转化系统对LtuHMGS基因编码蛋白进行亚细胞定位;采用RT-qPCR技术分析LtuHMGS基因在北美鹅掌楸的组织表达谱。【结果】LtuHMGS基因的ORF全长1425 bp,共编码474个氨基酸,蛋白质分子式为C_(2340)H_(3608)N_(614)O_(721)S_(24),分子量为52.65 kD,α-螺旋为其氨基酸序列的主要二级结构且该蛋白不含信号肽和跨膜区域,是一种非分泌型蛋白。对LtuHMGS蛋白的保守结构域预测分析发现其氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合酶保守结构域,亚细胞定位表明LtuHMGS蛋白可能更多地存在于细胞质膜中。同源序列比对和系统进化树分析表明,北美鹅掌楸LtuHMGS蛋白序列与其他物种的序列高度相似且与樟科的沉水樟和山鸡椒的HMGS蛋白的进化关系更近。RT-qPCR结果发现,LtuHMGS基因在北美鹅掌楸雌蕊中的表达量远高于其他组织。【结论】从北美鹅掌楸中克隆得到1条编码羟甲基戊二酰辅酶A合酶的候选基因(LtuHMGS),该基因可能参与北美鹅掌楸萜类物质的合成,是研究北美鹅掌楸萜类合成机制的关键酶基因之一。

北美鹅掌楸LtAGO1基因的克隆、表达及其启动子分析

为深入探究叶原基分化成叶器官的形态建成机制,该研究以北美鹅掌楸为材料,采用RT-PCR和RACE克隆技术获得LtAGO1的cDNA全长和启动子序列并预测其功能,通过RT-qPCR分析LtAGO1在鹅掌楸属中的组织表达模式。同时,经抗性筛选和DNA鉴定获得ProAGO1∷GUS的转基因拟南芥株系,并进一步对T2代阳性植株进行表型和GUS组织化学染色分析。结果表明:(1)LtAGO1基因包含3300 bp的开放阅读框,编码1100个氨基酸,分子量为122.14 kD,理论等电点(pI)为9.36。(2)氨基酸序列分析显示LtAGO1含Gly-rich-AGO1和Piwi两个典型的AGO基因结构域,同源性分析显示LtAGO1蛋白与沉水樟AGO1蛋白(RWR84608.1)亲缘关系最近。(3)组织表达特异性分析显示LtAGO1在北美鹅掌楸不同组织间的相对表达量为雄蕊>花芽>花瓣>花萼>叶片>雌蕊>叶芽>茎,LtAGO1在北美鹅掌楸叶片不同发育阶段的相对表达量为叶芽萌动期>幼叶期>衰老期>成熟期,AGO1在鹅掌楸属叶缘的表达量高于叶片的其他部位且北美鹅掌楸叶凹陷部位的表达量高于叶尖部位。(4)获得叶中-侧轴向和基-顶轴向的极性缺失、叶缘锯齿、重瓣花型的转化株系,GUS组织染色显示ProAGO1启动GUS基因在叶芽顶端稳定表达且在新分化的叶柄上表达较强,在成熟期的茎、叶、花和果的维管束中均特异表达。LtAGO1启动子的GUS活性强度为叶顶芽>花>维管束,这与实时定量PCR结果相一致。综上认为,LtAGO1基因在顶端分生组织特异表达且受到多种途径的调控而参与到叶和花器官的发育进程中。该研究结果为进一步了解北美鹅掌楸LtAGO1基因的基本功能及其调控叶形发育机制提供了理论基础。