美洲鲥雄性生殖细胞冷冻保存及移植

采用分离细胞冻存和组织块直接冻存2种方法,进行美洲鲥(American shad,Alosa sapidissima)精巢细胞的长时间冷冻保存(>250d),并比较分析2种不同冻存方法对美洲鲥雄性生殖细胞的冻存效果。解冻复苏后用Hochest33342和PI共染细胞核,分析统计各期雄性生殖细胞的存活率,结果显示组织块冻存方法所得精原干细胞和精母细胞的存活率明显高于分离细胞冻存的;而精细胞及其他细胞存活率在2种方法间无显著差异;特别是,镜检发现组织块冻存方法所得精子存活率高达93.83%,说明此冻存方法能同时高效地冻存美洲鲥各期生殖细胞,包括成熟的精子。同时,将组织块冻存的美洲鲥生殖细胞用PKH26染色标记后移植到出苗第1天的斑马鱼仔鱼中,在细胞植入后5d仍能在受体中检测到供体细胞,且有部分供体细胞能与内源生殖细胞共定位,表明经过长时间冷冻保存的美洲鲥生殖细胞仍具有生殖细胞特性,且能整合到斑马鱼受体性腺原基。研究结果为进一步开展美洲鲥,或其他洄游性鱼类的生殖细胞发育、培养及种质资源保存等研究工作奠定了技术理论基础。

中华鳖dazl基因克隆及在生殖细胞中的表达

为探索龟鳖类生殖细胞的发育分化机制,实验通过特异性引物克隆了中华鳖dazl基因的cDNA片段,长1 007 bp,其中包括5′端非编码区197 bp,3′端非编码区33 bp,开放阅读框777 bp,编码258个氨基酸。氨基酸序列比对显示其与西部锦龟Dazl同源性最高,达96%;与小鼠Dazl同源性达75%。荧光定量PCR分析结果显示,中华鳖dazl mRNA主要在精巢和卵巢中表达,在体细胞组织中仅检测到微量表达。冰冻切片原位杂交结果显示,中华鳖dazl mRNA在生殖细胞中特异表达,且在不同时期的生殖细胞中呈动态表达模式。在精巢中,中华鳖dazl mRNA在初级和次级精母细胞中表达最强,在精原干细胞中表达水平次之,在精子细胞中未检测到信号;在卵巢中,中华鳖dazl mRNA信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布且在最早期的初级卵母细胞中信号最强,随着卵母细胞的增大,信号逐渐聚集并逐渐减弱。研究表明,dazl基因可能对中华鳖两性生殖细胞的发生具有重要的调控作用。

中华鳖figlα基因的克隆及其在性腺中的表达分析

为解析中华鳖figlα基因功能及其对配子生成的作用机制,本研究开展了中华鳖figlα基因的cDNA序列克隆及其mRNA表达模式分析。克隆获得的figlα基因cDNA序列为714 bp,包含长72个碱基的3'UTR和长642个碱基的开放阅读框(open reading frame,ORF),共编码213个氨基酸。中华鳖Figlα蛋白序列与西部锦龟Figlα蛋白的同源性高达93%,且包含一个Figlα蛋白高度保守的bHLH(basic helix-loop-helix)结构域,因此被命名为PSFiglα。同时,NJ系统进化树分析显示中华鳖Figlα蛋白与哺乳类、鸟类的聚为一支。荧光定量PCR分析发现中华鳖figlα基因主要在性腺中表达:在卵巢中表达最强,精巢中表达较弱,而在其它体组织中均未检测到明显的表达。冰冻切片原位杂交分析表明:中华鳖figlαmRNA在其卵子发生过程的各期卵泡中均有表达,在初级卵母细胞(Ⅱ~Ⅴ期)中表达最强且主要分布在卵母细胞的胞质中;在生长卵母细胞(Ⅵ~Ⅸ期)及成熟卵母细胞(Ⅹ期)中,figlαmRNA主要分布在卵母细胞胞质及其周边的滤泡细胞中。在精巢中,中华鳖figlαmRNA在初级精母细胞中表达最强,在次级精母细胞和精子细胞中表达较强,在精原细胞中表达较弱,而在体细胞中几乎检测不到信号。研究结果表明figlα基因可能主要调控中华鳖卵泡的形成及其卵巢的发育,同时可能在中华鳖精子发生过程中也有一定的调控作用。本研究为进一步开展中华鳖及其它爬行动物配子生成以及性腺发育分化的研究奠定了基础。

中华鳖boule基因在生殖细胞中的表达分析

boule基因为DAZ基因家族成员之一,是动物生殖细胞特异表达基因。在哺乳动物中,boule基因的缺失会引起精子生成障碍而导致雄性不育。在无脊椎动物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中,boule基因同源物的缺失会引起其卵子发生障碍而导致雌性不育。龟鳖动物是最古老的爬行类,是从无羊膜卵到羊膜卵动物飞跃的过渡物种。相比于哺乳类及一些无脊椎动物,目前关于龟鳖动物生殖细胞发育模式的研究还非常有限。因此,本文以中华鳖(Pelodiscus sinensis)为研究对象,以期揭示boule基因对龟鳖动物生殖细胞发育分化的调控作用。首先,利用特异引物克隆获得中华鳖boule基因的cDNA序列,共1 005 bp,其中,3′端非编码区57 bp,开放阅读框948 bp,共编码315个氨基酸。氨基酸序列多重比对分析显示,中华鳖与绿海龟(Chelonia mydas)同源性最高,达92%,与小鼠(Mus musculus)的同源性达83%,与果蝇(Drosophila melanogaster)的同源性达53%,与青鳉(Oryzias latipes)的同源性达42%。反转录实时定量PCR(RT-qPCR)分析结果显示,中华鳖boulem RNA主要在性腺组织精巢和卵巢中表达,而在其他体细胞组织中几乎检测不到表达。原位杂交结果显示,中华鳖boule m RNA在两性生殖细胞中特异表达,且在不同分化时期的生殖细胞中呈动态表达。在精巢中,boule m RNA在初级精母细胞中表达最强,在精原细胞和次级精母细胞中表达较弱,在精子细胞和精子中难以检测到表达信号;在卵巢中,boule mRNA在初级卵母细胞中表达信号最强且信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布,生殖细胞发育进入卵母细胞生长期后,信号开始聚集在核周胞质,随着卵母细胞的成熟,信号逐渐变弱。本研究结果表明,boule基因可能在中华鳖两性生殖细胞的减数分裂过程中均具有重要的调控作用。