早发性白内障与年龄相关性白内障患者房水代谢组学的差异研究

目的:探讨早发性白内障与年龄相关性白内障患者房水中代谢物及代谢通路的差异。方法:代谢组学研究。收集2020年8月至2022年9月就诊于天津医科大学眼科医院的16例(17只眼)白内障患者。其中早发性白内障8例(8只眼),年龄相关性白内障8例(9只眼)。收集患者年龄、性别、术前裸眼视力、眼压、晶状体功能失调指数和眼轴长度等一般临床资料,并于白内障摘除术中留取房水和前囊膜组织标本,采用液相色谱-串联质谱法非靶向检测房水中的代谢物,进一步使用主成分分析、差异分析、聚类分析、相关性分析筛选差异代谢物,并根据代谢物的变化倍数(FC)对差异代谢物进行排名。使用受试者工作特征(ROC)曲线分析和代谢富集分析来筛选两组间的差异通路,并鉴定早发性白内障的生物标志物。前囊膜组织行免疫组织化学染色。采用比色法检测丙酮酸含量验证代谢组学分析结果。结果:8例早发性白内障患者中男性7例,女性1例,年龄(37.50±4.90)岁;8例年龄相关性白内障患者中男性7例,女性1例,年龄(73.44±5.22)岁;基线资料除年龄外差异均无统计学意义(P>0.05)。差异分析共鉴别出347种差异代谢物,其中10种经ROC曲线分析确定为潜在的早发性白内障生物标志物(均P<0.05),其中阳离子(POS)模式5种,分别是丙氧卡因(log 2FC=7.26)、2-甲基-2,3,4,5-四氢-1,5-苯并氧氮杂卓-4-酮(log 2FC=6.35)、l-焦谷氨酸(log 2FC=-1.72)、亮氨酰脯氨酸(log 2FC=-0.77)和胆碱(log 2FC=-0.56),阴离子(NEG)模式5种,分别是N-苯乙酰谷氨酰胺(log 2FC=-1.84)、丙酮酸(log 2FC=1.07)、抗坏血酸(log 2FC=0.92)、假尿嘧啶核苷(log 2FC=-0.68)和棕榈酸(log 2FC=-0.51)。代谢富集分析共富集到72条差异通路(POS模式32条,NEG模式40条),其中谷胱甘肽代谢及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、糖酵解或糖异生、丙酮酸代谢、三羧酸循环两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。验证结果显示早发性白内障患者房水中乳酸脱氢酶减少,丙酮酸升高(P<0.05)。结论:丙酮酸等10种代谢物可能是潜在的早发性白内障生物标志物;谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、糖酵解或糖异生、丙酮酸代谢和三羧酸循环代谢通路在早发性白内障患者中明显失调。

NDRG1基因在体外对视网膜血管内皮细胞血管形成能力的影响

目的观察高糖状态下NDRG1对恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增殖、迁移和管腔形成能力的影响。方法将RF/6A细胞分为正常组、甘露醇组、高糖组、无靶基因的小干扰RNA(siRNA)阴性对照组(siRNA组)、30 nmol/L siRNA下调NDRG1基因组(siNDRG1组)、50 nmol/L siNDRG1组。正常组细胞常规培养;甘露醇组细胞加入25 mmol/L甘露醇培养;高糖组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养;siRNA组细胞加入25 mmol/L葡萄糖,再加入空白siRNA诱导培养;30、50 nmol/L siNDRG1组细胞均加入25 mmol/L葡萄糖,再分别用30、50 nmol/L siNDRG1进行诱导。所有细胞均孵育24 h进行后续实验。4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察细胞增殖;细胞计数试剂盒8染色检测细胞活性;实时定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平;细胞划痕实验观察细胞迁移;细胞管腔形成实验检测管腔形成。两组间比较采用双尾Student t检验;多组间比较采用单因素方差分析。结果高糖组与正常组、甘露醇组细胞增殖率(t=36.659、57.645)、迁移率(t=24.745、33.638)、管腔形成数量(t=41.276、22.867)比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。与正常组、甘露醇组比较,高糖组细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(t=46.145、21.541、36.738、32.976,P<0.001)。与siRNA组比较,30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量明显降低,差异有统计学意义(t=44.275、40.7577、57.167、25.877,P<0.01)。与正常组、siRNA组比较,30 nmol/L siNDRG1组细胞迁移率增加,差异有统计学意义(t=57.562、49.522,P<0.01)。与正常组、siRNA组比较,30 nmol/L siNDRG1组相同视野下细胞管腔形成数量明显增加,差异有统计学意义(t=63.446、42.742,P<0.01)。结论下调NDRG1基因可诱导高糖状态下RF/6A细胞活性、细胞迁移和管腔形成能力的提高。

糖尿病小鼠视网膜p21活化激酶4表达上调及其对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响

目的观察p21活化激酶4(PAK4)对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响。方法实验研究,分为体内动物实验和体外细胞实验两部分。体内动物实验:健康C57BL/6J雄性小鼠12只,随机分为正常对照组、糖尿病组,每组各6只小鼠。糖尿病组小鼠经链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型。建模后8周,采用蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜PAK4表达情况。体外细胞实验:人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)分为常规培养细胞组(N组)、空载体组(Vector组)、PAK4过表达组(PAK4组)。各组加人150μg/ml糖基化终末产物诱导细胞。细胞划痕实验检测各组hRMEC内细胞迁移情况;流式细胞仪检测各组白细胞粘附于hRMEC数量。SeahorseXFe96细胞能量代谢分析仪测定细胞内线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷(ATP)生成、最大呼吸与备用呼吸能力。两组间比较采用检验;三组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与正常对照组小鼠比较,糖尿病组小鼠视网膜中PAK4mRNA、蛋白相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(t=25.372、22.419、25.372,P<0.05)。体外细胞实验:与N组、Vector组比较,PAK4组hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相对表达量和细胞迁移率均显著升高,差异有统计学意义(F=36.821、38.692、29.421,P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,PAK4组hRMEC上白细胞粘附数量明显升高,差异有统计学意义(F=39.649,P<0.01)。线粒体压力测量结果显示,PAK4组hRMEC内线粒体基础呼吸、ATP生成、最大呼吸与备用呼吸能力明显减弱,差异有统计学意义(F=27.472、22.315、31.147、27.472,P<0.05)。结论PAK4高表达损伤线粒体功能并显著促进白细胞粘附和内皮细胞迁移。

二甲双胍抑制糖尿病视网膜血管内皮细胞中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3炎症小体活化和细胞焦亡

目的观察二甲双胍(Met)对糖尿病(DM)微环境下人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体及细胞焦亡的影响。方法实验研究,分为体内动物实验和体外细胞实验进行。体内动物实验:健康C57BL/6J雄性小鼠9只,随机分为DM组、正常对照组、DM+Met处理组(DM+Met组),每组各3只小鼠。DM组、DM+Met组小鼠经链脲佐菌素诱导建立DM模型;DM+Met组给予Met400mg/(kg·d)干预。建模后8周,免疫组织化学染色观察正常对照组、DM组、DM+Met组小鼠视网膜NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D(GSDMD)、cleaved-半胱天冬酶1(Caspase-1)的表达。体外细胞实验:hRMEC分为常规培养细胞组(N组)、晚期糖基化终末产物(AGE)组、AGE+Met组。AGE组、AGE+Met组加入150μg/mlAGE诱导细胞,AGE+Met组另加入2.0mmol/LMet处理细胞。流式细胞仪检测各组细胞焦亡情况;2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测各组细胞中活性氧(ROS)表达;实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测各组细胞中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1mRNA、蛋白相对表达量。三组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与DM组比较,正常对照组、DM+Met组小鼠视网膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达显著降低;三组间比较,差异有统计学意义(F=43.478、36.643、24.464,P<0.01)。体外细胞实验:流式细胞仪检测结果显示,AGE组细胞焦亡率显著高于N组、AGE+Met组,差异有统计学意义(F=32.598,P<0.01)。DCFHDA检测结果显示,N组、AGE+Met组细胞内ROS水平较AGE组明显降低,差异有统计学意义(F=47.267,P<0.01)。AGE+Met组细胞中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA(F=51.563、32.192、44.473,P<0.01)和蛋白(F=63.372、54.463、48.412,P<0.01)相对表达量较N组显著下降。结论Met可下调hRMEC内NLRP3炎性小体相关因子表达并抑制细胞焦亡。