马疱疹病毒1型UL56蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多克隆抗体反应性。结果显示,纯化后的pUL56可以与EHV-1阳性血清发生反应;pUL56多克隆抗体的效价为1∶128 000,并能与pUL56特异性结合。本研究成功制备具有良好反应性的pUL56多克隆抗体,为pUL56功能特性及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。

市政自来水工程施工技术与经验研究

在城镇化建设的全力推进下,对城市基础设施建设的要求越来越高,细节也越来越完善。市政自来水工程是现代城市发展的重要组成部分。它不仅在人们日常生活中扮演着至关重要的角色,还对城市的经济、环境和社会发展起到了积极的推动作用。因此本文将重点针对市政自来水工程施工技术与经验进行研究,希望提高技术应用效果,促进我国市政自来水工程得到持续发展。

自来水管道带压作业施工技术研究

自来水管道带压作业能够保持供水系统的正常运行。在带压作业过程中,供水不会中断,用户的用水需求能够得到满足。这对于居民、企业和社会的正常生产和生活具有重要意义。通过科学合理的施工方式和技术手段,能够减少管道的关闭时间和次数,最大限度地保障供水系统的连续稳定运行。基于此,本文详细分析了自来水管道带压作业施工技术策略,以供参考。

马疱疹病毒1型gp2基因分子特征

为了探索α疱疹病毒亚科的马疱疹病毒特有基因gp2的功能及分子结构,本试验以EHV-1 XJ2015株为研究对象,扩增其gp2基因并测序,继而进行遗传进化分析、氨基酸序列差异性分析和蛋白质性质分析。结果显示,30株EHV-1病毒gp2蛋白氨基酸序列相似性达90.38%;gp2蛋白预测包括1个信号肽、1个螺旋跨膜结构域和1个核外运信号;gp2蛋白二级结构以无规卷曲为主,高达88%,极性分子居多,亲水性氨基酸占52.02%,第25~130位和第273~565位氨基酸亲水性和抗原性较强,易形成潜在的抗原表位。由此可见,gp2基因属于EHV-1较保守的基因,gp2蛋白是分泌型蛋白,且具有良好的抗原性。本试验为进一步解析EHV-1 gp2基因及其编码蛋白功能、制作基因工程疫苗和诊断试剂提供了生物信息学依据。

一株新疆野鸟源新城疫病毒的分离鉴定、F基因克隆及遗传进化分析

为了解新疆野鸟新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染情况,分析其分子特征和基因变异特点,防止新城疫的暴发和蔓延,本试验用9日龄SPF鸡胚进行病毒的分离传代,HA、HI试验和RT-PCR方法对位于"东非—西亚迁徙线"福海县的野鸟进行了NDV检测,分离到1株野鸟源NDV,并命名为NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016。结果表明,该NDV分离株F基因ORF长1 662bp,编码553个氨基酸,F基因碱性裂解位点序列为^(112)G-R-Q-G-R-L^(117),符合弱毒株特征;遗传进化分析显示,NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016与乌克兰鸽源分离株Doneck/3/968、比利时鸭源分离株Simeonovgrad核苷酸同源性均为99.7%,属于NDV ClassⅡ基因Ⅱ型。而上述3株病毒均与疫苗毒La Sota具有较高同源性(99.5%~99.8%)。本研究结果为家禽NDV外流进入自然环境提供了论据。

“情境教学”在生物教学中的运用

新课程改革要求我们教学要从学生的学习兴趣、生活体验和认知水平出发发展学生的综合能力。情境教学使学生在课堂上积极主动地参与活动，快乐地体验生活，从而扎实地提高技能。本文从以下几个方面提出如何创设情境：以日常生活中的疑惑问题创设情境；以鲜为人知的趣闻谈起，创设情境；以优美的语言，创设情境；以真实的体验，创设情境。

马疱疹病毒1型ORF5基因分子特征分析及原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(EHV-1)对马产业造成严重的经济损失。该病的防控主要依赖疫苗免疫,但是现有的检测方法不能有效区分疫苗免疫与自然感染,给流行病学调查和疫病的防控带来了一定的阻碍。本研究聚焦EHV-1的非结构蛋白,以EHV-1 XJ2015株为研究对象,扩增ORF5基因进行其遗传进化分析、氨基酸序列差异性分析、蛋白质性质分析,并根据分析结果设计引物扩增保守性与抗原性高的片段,构建原核表达载体,结果表明与31株EHV-1病毒ORF5基因核苷酸序列相似性达94.9%~100%,EICP27蛋白包含一个核定位信号,无核外运信号、无跨膜螺旋结构域、无信号肽,第75~204位氨基酸易形成潜在的抗原表位;对重组质粒pET-32a(+)-NSP5进行PCR鉴定,进行凝胶电泳观察结果,条带大小与目的基因相符,表明重组质粒pET-32a(+)-NSP5构建成功。本研究为区分EHV-1自然感染与疫苗免疫的检测方法的建立奠定基础。

新疆和田地区1株小鹅瘟病毒分离鉴定及VP基因的克隆分析

为了找到新疆和田地区某鹅场雏鹅大量死亡的原因,试验采用PCR方法及琼脂扩散试验检测了病死鹅组织,将阳性病料经无菌处理后接种无免番鸭胚,盲传3代,进行病毒分离;设计GPV VP基因特异性引物对其尿囊液进行扩增,构建重组质粒和测序,分析VP基因核苷酸序列同源性、亲缘关系,以及VP蛋白的抗原表位。结果表明:PCR检测及琼脂扩散试验结果均为阳性,其他常见病毒PCR检测结果为阴性;接种病料组织研磨悬液后无免番鸭胚出现典型症状,最终分离到一株GPV分离株,将其命名为GPV/GOOSE/XJHT/2020。该毒株VP基因核苷酸序列与GenBank中不同国家地区毒株的相似性均在95.0%以上;与强毒株DY16、RC16核苷酸序列的相似性均为99.3%,亲缘性高且处在同一分支;与疫苗株SYG61v、弱毒株GPV-98E的相似性均为95.0%,亲缘性较低且处在不同分支。VP蛋白具多个潜在的抗原表位。说明该鹅场存在GPV感染,且与国内毒株亲缘关系较近。

马疱疹病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确地检测马疱疹病毒1型(equine herpesvirus 1,EHV-1),本研究根据EHV-1基因组序列进化分析筛选出特异性较高的ORF68基因的保守区域设计引物与探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该方法线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,最低检测量为10.2拷贝/μL,比常规PCR敏感1000倍;特异性强,检测EHV-2、EHV-4、EHV-5、马动脉炎病毒和马流感病毒均无交叉反应;重复性好,组内及组间样本检测的Ct值均小于等于2%;对2020年收集的60份伴有呼吸道症状的马匹鼻试子进行检测分析显示本方法的阳性检出率(26.67%)高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR(23.33%)和常规PCR(21.67%)。本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异性强的TaqMan荧光定量PCR检测方法,可用于EHV-1的快速诊断和核酸定量检测,为EHV-1的防控工作提供了有力手段。

马疱疹病毒1型ORF2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

研究旨在克隆马疱疹病毒1型(EHV-1)ORF2基因,通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白,制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列(GenBank:MT063054)设计1对引物,将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中,通过Transetta(DE3)感受态细胞,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达ORF2蛋白,使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化,免疫BALB/c小鼠,检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示:ORF2基因成功克隆至原核表达载体pET-28a中,并通过大肠杆菌表达系统得到ORF2蛋白,大小约为38 ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA纯化树脂获得纯度较高的重组蛋白,能够与EHV-1阳性血清特异性结合;间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价为1∶64000,RK-13表达的ORF2蛋白可被多克隆抗体能特异性识别。研究表明,大肠杆菌表达的ORF2重组蛋白具有良好反应原性,ORF2蛋白制备的多克隆抗体效价高、特异性强,可为ORF2蛋白的生物学功能和基因缺失疫苗的研究奠定基础。

马疱疹病毒1型gp2基因缺失株的构建及生长特性分析

构建针对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的转移载体pUC-gp2^(-)LR和pUC-gp2^(-)LR-EGFP;将EHV-1 XJ2015基因组与pUC-gp2^(-)LR-EGFP共转染至RK-13细胞,利用EGFP基因筛选获得EHV-1 XJ2015-gp2^(-)/EGFP+毒株,以此毒株基因组与pUC-gp2^(-)LR共转染至RK-13细胞,筛选去除EGFP基因的EHV-1 XJ2015-gp2^(-)毒株并通过生长曲线、蚀斑形态、易感细胞连续传代评价其增殖能力和遗传稳定性。结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,获得能稳定遗传的EHV-1 XJ2015-gp2^(-),该毒株的生长曲线与亲本株存在差异,增殖能力下降约2个病毒滴度;两者的空斑面积平均值分别为0.378 mm^(2)和1.698 mm^(2),差异极显著(P<0.01)。结果表明,成功获得EHV-1 gp2基因缺失株,该毒株的体外生长动力学较亲本毒弱,为研制EHV-1减毒活疫苗奠定了基础。