牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究

布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。