基于MDCK悬浮细胞灌注培养的流感病毒生产过程开发

为了提升用MDCK悬浮细胞培养生产流感疫苗的效率,克服目前存在的产能低下问题,以期满足日益增长的流感疫苗市场需求和提升应对大流行爆发的能力。通过病毒驯化、稀释流加条件下的细胞生长和产毒能力分析、Semi-perfusion中的细胞高密度培养可行性分析以及ATF灌注反应器过程验证完成过程开发。驯化的病毒加速了其在细胞内的感染扩增,且在稀释流加培养中获得(3.57±0.17)log10(HAU/100μL)的病毒滴度。Semi-perfusion可实现细胞高密度培养至40×106 cells/mL以上,病毒产量达4 log10(HAU/100μL)以上,同时发现MOI和胰酶浓度对病毒的复制过程存在显著影响。在反应器中的ATF灌注培养过程得到了与Semi-perfusion相近的细胞密度及更高的病毒产量4.37 log10(HAU/100μL),并且通过降温措施维持了高密度下的单细胞病毒产量,克服了“细胞密度效应”。建立了基于MDCK悬浮细胞ATF灌注培养的流感病毒生产平台,通过同时提高细胞密度和单细胞病毒产率提升了流感病毒的生产效率,为基于细胞培养的流感疫苗产业化生产提供了新选择。

H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8~32 mL范围内具有良好的线性关系(R^2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。

高雅的蝴蝶兰

早晨，我起床来到餐桌旁，一股清香扑鼻而来，仔细搜寻，原来是那株浓妆艳抹的蝴蝶兰发出来的。这盆蝴蝶兰造型独特，球形的花苞像一个个小铃铛在微风中互相碰撞着，也像一群婀娜多姿的蝴蝶停留在花茎上。它们各有各的姿态，