干扰PTEN基因表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞周期的影响及相关机制研究

目的:研究干扰PTEN表达对He La细胞细胞周期分布的影响并探索其相关机制。方法:以人宫颈癌细胞系He La为实验对象,利用慢病毒转染技术导入PTEN-特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干扰PTEN表达,采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转染前后PTEN及细胞周期蛋白Cyclin B1 m RNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期分布变化,蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞后利用Western blot检测Cyclin B1蛋白稳定性变化。结果:PTEN sh RNA作用He La细胞后,PTEN m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低;下调PTEN表达后,细胞周期中G2/M期细胞比例与对照组相比明显增加,Cyclin B1蛋白表达水平下降,但Cyclin B1 m RNA水平与对照组相比无明显差异。MG-132处理细胞后,PTEN干扰组中Cyclin B1蛋白表达与未处理组相比明显增加。结论:在He La细胞中干扰PTEN表达会导致细胞周期阻滞于G2/M期,这可能与细胞周期相关蛋白Cyclin B1表达水平降低有关。

敲低PTEN表达对纺锤体正常结构的破坏作用及其相关机制研究

目的探讨PTEN干扰对有丝分裂纺锤体形成的影响及其可能机制。方法用慢病毒干扰载体及阴性对照载体转染HeLa细胞后采用qPCR及Westernblot技术检测PTEN mRNA及蛋白表达水平，有丝分裂测定实验镜下观察细胞有丝分裂指数，免疫荧光染色技术观察纺锤体的形态、结构，Westernblot实验检测Eg5蛋白表达变化。结果PTEN shRNA转染HeLa细胞后，PTEN的mRNA及蛋白表达水平均明显下调（P〈0．05）；与对照组相比，shPTEN组细胞的有丝分裂指数明显上调（P〈0．01）；免疫荧光结果显示shControl组中可见正常的纺锤体形成，而shPTEN组中可见形态及结构异常的纺锤体，且纺锤体的长度显著小于对照组（P〈0．01）；驱动蛋白Eg5在shPTEN组中表达明显低于对照组（P〈0．05）。结论PTEN干扰可能通过下调Eg5蛋白的表达水平导致有丝分裂及纺锤体形成异常。

PTEV干扰对甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1侵袭能力的影响及其相关机制研究

目的研究PTEN干扰对甲状腺滤泡上皮细胞Nthy—ori3—1侵袭能力的影响，并初步探讨其可能的分子机制。方法以人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy—ori3—1为研究对象，通过慢病毒感染技术将PTEN特异性短发夹RNA（shRNA）及无关序列shRNA导入细胞。实验分为2组：无关序列组（shContr01）和干扰PTEN组（shPTEN）。通过Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力，免疫荧光检测侵袭相关蛋白在细胞表面的表达水平，Westernblot检测相关蛋白的表达水平。结果与无关序列组相比，干扰PTEN组细胞的形态发生明显改变，侵袭相关蛋白E—cadherin的表达水平明显降低，细胞的侵袭能力增强，侵袭相关蛋白E—cadherin在细胞表面的表达水平降低。结论PTEN干扰能够促进甲状腺滤泡上皮细胞Nthy—ori3—1的侵袭，且这一作用可能是通过下调侵袭相关蛋白E—cadherin的表达实现的。