棉铃虫抗药性监测方法——浸叶法敏感毒力基线的建立及其应用

通过室内饲养的 2个棉铃虫敏感品系 ,用浸叶法建立了 11种常用药剂 (氯氰菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯、氰戊菊酯、久效磷、辛硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱、灭多威、硫双灭多威、硫丹 )的敏感毒力基线 ,确定了它们的LC50 值和区分剂量。并用浸叶法监测了江苏、山东、河南、安徽4省棉田 2代棉铃虫对氯氰菊酯、久效磷、灭多威和辛硫磷的抗性 ,结果表明用区分剂量监测抗性个体频率既快速简便 ,又适宜于进行早期抗性检测 ,因此这 4种药剂的区分剂量可以推广应用于棉铃虫田间抗药性监测。

铃虫对氰戊菊酯抗性和敏感品系的选育

用氰戊菊酯对来自阳谷的棉铃虫（ＹＧ）Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ）进行抗性品系的筛选。在１５代期间经过９代的室内选育，获得抗性品系（Ｆｅｎ－Ｒ），抗性倍数高达２４６３倍，筛选后Ｆ１，代ＬＤ５０值（２４．１４１２ｇ／头）比筛选前Ｆ１代ＬＤ５０值（０．２０２０ ｇ／头）提高了１１９．５倍。对来自偃师的棉铃虫（ＹＳ）进行了连续两代单对筛选，得到敏感品系（Ｆｅｎ－Ｓ），敏感品系的ＬＤ５０值为０．０１１６ｇ／头，接近１９８３年东台敏感品系的ＬＤ５０值（０．００９８ｇ／头）。Ｆｅｎ－Ｒ抗性品系筛选前后分别测定了七种杀虫剂的剂量－死亡回归线，发现Ｆｅｎ－Ｒ抗性品系对溴氰菊酯［ＬＤ５０（Ｆｅｎ－Ｒ）ＬＤ５０（ＹＧ）＝５．２Ｘ］和氯氰菊酯（２．５Ｘ）具有一定程度的交互抗性；而对功夫菊酯（０．６６Ｘ），氯菊酯（０．８７Ｘ）、灭多威（０．７４Ｘ）及久效磷（１．５Ｘ）没有交互抗性。氰戊菊酯加Ｐｂ的增效试验结果表明棉铃虫对氰戊菊酯的抗性主要是由于多功能氧化酶的代谢作用。毒理学资料还暗示抗性为多因子（基因）的。

棉铃虫对氰戊菊酯抗性品系和敏感品系的相对适合度

通过构建棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ）对氰戊菊酯抗性品系（Ｆｅｎ－Ｒ）和敏感品系（Ｓ）的实验种群生命表，比较了一系列生长发育和繁殖特征；并用净增殖率（Ｒ。）来确定两个品系的相对适合度。结果表明，Ｆｅｎ－Ｒ品系与敏感品系相比具有一定程度的繁殖不利性，包括雌蛾交配率降低，每头雌蛾的平均产卵量减少以及较低的卵孵化率；没有观察到Ｆｅｎ－Ｒ品系在生长发育上的不利性。Ｆｅｎ－Ｒ品系相对于敏感品系具有０．６９的适合度。

增效醚(PBO)对棉铃虫细胞色素P450的抑制作用及对拟除虫菊酯的增效作用

在增效醚 (PBO)对棉铃虫Helicoverpaarmigera 3龄幼虫处理后的不同时段 ,细胞色素P45 0的含量受到不同程度的抑制 :在处理后 1h ,细胞色素P45 0的含量仅为对照的 43 9% ,至处理后 12h ,细胞色素P45 0的含量下降到最低点 ,仅为对照的 2 3 4% ;而处理后 18～ 2 4h ,细胞色素P45 0被抑制的程度有所减弱 ,其含量分别为对照的 85 8%和 70 0 %。生物测定结果表明 ,PBO对所测定的 7种拟除虫菊酯均有不同程度的增效作用 ,对氰戊菊酯的增效比最高 (119 3) ,对氯菊酯的增效比最低 (2 1)。由于细胞色素P45 0是拟除虫菊酯的重要解毒酶系 ,PBO的处理可使棉铃虫细胞色素P45 0的含量大幅度下降 ,使其对杀虫剂的解毒能力减弱 。

山东省阳谷县棉铃虫抗药性监测

采用三龄幼虫点滴法，于１９９０～１９９３年连续４年对位于冀、鲁、豫三省交界处抗性中心区的山东省阳谷县棉铃虫的抗药性进行了系统监测（每年测定田间第二、四代，每代测定８个药剂）．结果表明：该县棉铃虫对氰戊菊酯的抗性水平最高（４０．５～５４２．８倍），对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、顺式氰戊菊酯和灭多威处于中等抗性水平（１０～５０倍），对久效磷为低水平抗性（＜５倍）。文中还讨论了该县棉铃虫抗药性发生、发展的特点，并就中国棉铃虫抗药性治理策略提出了一些设想。

用点滴法和浸叶法监测棉铃虫抗药性的比较

本文分别采用点滴法和浸叶法，监测了山东省阳谷县、河南省新乡县、河北省邯郸市和安徽省萧县第２代棉铃虫对氯氰菊酯、灭多威及久效磷的抗性，并对这两种方法的监测结果进行了比较。从同一种药剂对４个地区棉铃虫毒力大小顺序来看，两种方法的测定结果基本一致。而从抗性倍数来看，点滴法与浸叶法的结果具有差异：点滴法测得的氯氰菊酯的抗性倍数（２０．８～３４．８倍）高于浸叶法测得的抗性倍数（２．０～１８．７倍），对灭多威测得的抗性倍数（５．４～１６．４倍）也高于浸叶法测得的抗性倍数（１．４～６．５倍）；而浸叶法测得的对久效磷的抗性倍数（１１．３～７０．１倍）却明显高于点滴法测得的抗性倍数（２．８～９．３倍）。本文并对产生这种差异的原因进行了分析和讨论，建议对有机磷杀虫剂采用浸叶法作抗性监测比较确。

棉铃虫对氰戊菊酯抗性遗传分析

本文采用剂量对数－死亡机率值回归线（ＬＤ－Ｐ线）分析法，利用室内选育的棉铃虫ＨＥＬＩＣＯＶＥＲＰＡＡＲＭＩＧＥＲＡ（Ｈｕｂｎｅｒ）对氰戊菊酯抗性品系和敏感品系，研究了棉铃虫对氰戊菊酯的抗性遗传规律。结果表明，棉铃虫对氰戊菊酯的抗性为多基因遗传，其主要基因为不完全显性，抗性不属性连锁遗传。利用增效剂对抗性机理进行的研究表明，多功能氧化酶（ＭＦＯ）是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗药性的主要因子，因此。

棉铃虫对氰戊菊酯抗性机理研究

对于室内选育的棉铃虫抗性品系（ＹＧ－Ｒ，Ｒｄ）和采自田间的抗性种群（ＹＧ９２２１，ＹＧ９２４１，ＹＧ９３２１），ＰＢＯ对氰戊菊酯都具有明显的增效作用，增效比为１９．５～１６９．５倍，而ＤＥＦ和ＴＰＰ对氰戊菊酯几乎没有增效作用。Ｒｄ抗性品系三龄幼虫多功能氧化酶艾氏剂环氧化活力是ＹＳ－Ｓ敏感品系的１．３６倍，而ＹＧ－Ｒ和Ｒｄ两个抗性品系分别与ＹＳ－Ｓ敏感品系相比，三龄幼虫酯酶活力没有差异。因此，多功能氧化酶解毒作用增强是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗药性的主要因子，而酯酶与抗性无关。用１４Ｃ－氰戊菊酯进行的表皮穿透研究表明，氰戊菊脂在抗性品系和敏感品系的表皮穿透速率上存在差异，表皮穿透速率降低是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗性的一个因子。棉铃虫对氰戊菊酯抗性品系与ＤＤＴ具有交互抗性，间接表明了神经敏感性下降也可能是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗性的一个因子。

棉铃虫对拟除虫菊酯抗性稳定性研究

研究棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ）对三种拟除虫菊酯（氰戊菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯）的抗性稳定性及敏感性恢复表明，即使棉铃虫对氰戊菊酯的抗性达到３１６６．３倍以上，抗性仍不稳定，经１４代室内饲养后抗性下降为６１．４倍；对一系列田间抗性种群的抗性稳定性研究后发现，棉铃虫对这三种拟除虫菊酯的抗性不稳定，在没有杀虫剂选择的情况下，开始几代抗性下降较快，当下降到一定水平（２～９倍）后，抗性比较稳定，很难完全恢复对拟除虫菊酯的敏感性。

棉铃虫对氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯抗性水平的比较

测定了氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯对不同棉铃虫品系３龄幼虫的毒力。结果表明，两者对敏感品系的ＬＤ５０值相差８．７倍，而对一系列抗性品系两者ＬＤ５０值相差２４．３～１７２．１倍；不同棉铃虫品系对氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯的抗性水平也存在显著差异，对氰戊菊酯的抗性为８１．８～２１４２．８倍，对顺式氰戊菊酯的抗性为２３．８～１６４．６倍。用室内选育的山东阳谷Ｓ６抗性品系进行测定，结果显示，增效醚对氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯的增效比分别为１１９．３和４．３，说明棉铃虫对两者的氧化代谢抗性机制差异很大。氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯对棉铃虫的毒力以及棉铃虫对两种药剂的抗性水平并不是简单的４倍关系，氰戊菊酯中大量无效异构体的存在可能有利于氧化代谢抗性机制的演化。

棉铃虫对Bt生物农药早期抗性及与转Bt基因棉抗虫性的关系

用饲料感染法建立了棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈüｂｎｅｒ）敏感品系（ＳＵＳ１）对Ｂｔ生物农药的敏感毒力基线和区分剂量，１９９５年测定了五省六县棉铃虫初孵幼虫对Ｂｔ生物农药的敏感性，结果表明：山东阳谷、河北邯郸、河南新乡、安徽萧县及江苏丰县棉铃虫已产生早期抗性，抗性个体百分率为５％～１０％，与敏感品系相比，ＬＣ５０值稍有增加，但斜率ｂ值明显变小；而江苏东台棉铃虫仍属敏感。这是国内外首次诊测到棉铃虫对Ｂｔ生物农药抗性。用棉叶喂饲法测定比较了转Ｂｔ基因棉花品系对不同种群棉铃虫的抗虫性效果，结果表明：用早期抗性的阳谷和新乡棉铃虫初孵幼虫接虫５ｄ后平均死亡率较敏感品系下降１６％～２９％，说明棉铃虫对Ｂｔ农药与转Ｂｔ生物基因棉花品系间存在交互抗性。还讨论了Ｂｔ农药的抗性治理对策。

棉铃虫田间种群Bt毒素Cry1Ac抗性基因频率的估算

采用改进的F1筛查法检测了2005年采自华北地区的棉铃虫Helicoverpaarmigera(H櫣bner)田间种群对Bt毒素Cry1Ac的抗性基因频率。2005年从河南安阳和河北沧县转Bt基因抗虫棉上采集二代棉铃虫卵,在室内用人工饲料饲养至2龄幼虫,用1μg/cm2的Cry1Ac活化毒素进行初筛,将初筛存活成虫与室内筛选的GYBT抗性品系成虫进行单对杂交,并用区分剂量(2·5μg/cm2)对F1代进行检测。经检测,2005年河南安阳棉铃虫种群和河北沧县棉铃虫种群对Cry1Ac抗性基因频率基本一致,分别为1·4×10-3和1·5×10-3。用毒素涂表法测定了2004、2005年采自河南安阳、河北高阳、河北沧县、新疆阿克苏和新疆沙湾棉铃虫田间种群对Cry1Ac活化毒素的敏感性水平,结果表明华北棉区与新疆内陆棉区棉铃虫种群对Cry1Ac的敏感性存在一定的地区性差异(<8倍)。总体上,我国华北棉区棉铃虫种群对Cry1Ac还未产生明显抗性,抗性基因频率处于正常水平。棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性风险依然存在,需要尽快启动全国性的早期抗性检测和预警工作。

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因:CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1569bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1590bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得)6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明:CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。

棉铃虫对辛硫磷抗性的选育、交互抗性及增效剂增效作用研究

1 991年采自河南偃师棉田的棉铃虫种群(简称 YS种群 )与敏感品系相比有 2 .7倍的抗性。该种群在室内经功夫菊酯 +辛硫磷 (1∶ 2 5 )筛选了 2 7代后 ,对辛硫磷的抗性达到 9.4倍 ,再单用辛硫磷对该种群筛选 2 1代 ,获得 6 3 .0倍的抗性。交互抗性测定结果表明 ,棉铃虫对辛硫磷产生高水平抗性后对灭多威具有比较明显的交互抗性 ,对久效磷具有一定程度交互抗性 ,对甲基对硫磷和丙溴磷只有较低水平的交互抗性。 3种增效剂 TPP、DEF和 PBO对辛硫磷的增效比分别为1 .4、2 4 .8和 1 .0 ,DEF的增效作用明显 ,使辛硫磷的抗性由 6 3倍降至 2 .5倍 ,初步证明酯酶是引起棉铃虫对辛硫磷产生抗性的重要原因。

东南沿海地区小菜蛾对Bt δ-内毒素和Bt制剂的抗性检测

采用浸叶法测定了2003年秋季、2004年春季采自广东惠州、福建福州、浙江杭州和江苏南京的小菜蛾Plutellaxylostella田间种群对Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa以及Bt制剂kurstaki亚种(Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki,Btk)的抗性水平。与敏感品系PHI_S相比,广东惠州田间小菜蛾种群的抗性水平最高,其对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性分别达到了168和120倍,均为高抗水平;对Btk制剂的抗性有47倍,达到了中抗水平;对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性(分别为5.8和5.6倍)。福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群抗性水平相近,对Cry1Ab和Cry1Ac具有低至中等水平抗性(8～28倍),对Btk制剂具有低水平抗性(3.5～7倍),对Cry1Aa和Cry2Aa还没有产生明显抗性。因此,在我国东南沿海地区要注意Btk制剂与Bt其他亚种制剂或其他生物杀虫剂轮换使用,以减小Bt制剂对小菜蛾的选择压力,延缓小菜蛾对Bt抗性的发展。

棉铃虫各龄期酯酶同工酶的比较

用高分辨率的薄层等电聚焦对棉铃虫各龄期幼虫的酯酶同工酶进行了比较，结果发现棉铃虫各龄幼虫都有10种相同的酯酶同工酶，它们的pl集中在pH3．5—5，5范围内。本文还从方法学的几个方面进行了探讨。

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA的克隆、序列分析与不同发育阶段表达分析

烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）介导昆虫中枢神经系统中胆碱能突触兴奋性神经递质的快速传递，也是新烟碱类杀虫剂和多杀菌素的作用靶标。本研究利用RT-PCR和RACE技术，克隆了小菜蛾Plutella xylostella nAChRα亚基的一个新基因（Pxx8）的全长cDNA（GenBank登录号为EU914853）。Pxα8的cDNA序列全长1744bp，开放阅读框为1602bp，编码534个氨基酸，具有nAChRd亚基的典型特征，与其他昆虫nAChRα8亚基具有77％～96％的相似性，与果蝇nAChR132亚基具有76％的相似性。既胡的开放阅读框存在单核苷酸多态性位点，导致多个位点氨基酸的替换。雌性4龄幼虫的多态性位点多于雄性4龄幼虫，而且雌、雄4龄幼虫的多态性位点均不相同。半定量RT—PCR研究结果表明，Pxcα8mRNA在成虫期表达量高于蛹期和4龄幼虫期。本研究结果为进一步研究小菜蛾nAChR亚基的多样性和对多杀菌素的靶标抗性机制提供重要基础。

与拟除虫菊酯抗性相关的烟粉虱钠通道基因突变及其检测

通过RT_PCR克隆了烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)南京种群 (B 生物型 )的钠离子通道结构域ⅡS4 - 6cDNA片段 ,证实了与拟除虫菊酯抗性相关的是位于第 92 5位亮氨酸到异亮氨酸的突变 (L92 5I) ,并建立了L92 5I突变的PASA检测技术。与SUD_S敏感品系相比 ,2 0 0 2年采自南京棉花上的烟粉虱种群对氯氰菊酯具有 77倍的抗性 ,用氯氰菊酯对该种群进行多次筛选后 ,该种群对氯氰菊酯的抗药性提高到 2 2 7倍。PASA检测结果表明筛选后的南京种群中 10 0 %个体都具有L92 5I突变 (6 1 1%的个体为L92 5I突变纯合子 ,38 9%的个体为杂合子 ) ,而未筛选的南京种群只有 75 %个体具有L92 5I突变 (35 %个体为L92 5I突变纯合子 ,4 0 %的个体为杂合子 ,2 5 %的个体为野生型 )。该结果表明了烟粉虱钠离子通道L92 5I突变与对拟除虫菊酯抗性密切相关。

棉铃虫对辛硫磷的抗性遗传方式

利用室内选育的棉铃虫对辛硫磷抗性品系(Phoxim-R)和室内长期饲养的敏感品系(BK77)进行遗传杂交,研究了棉铃虫对辛硫磷的抗性遗传规律。结果表明:Phoxim-R品系与BK77品系相比对辛硫磷具有129倍抗性,正反交后代对辛硫磷的抗性分别为22.6和25.3倍,表明棉铃虫对辛硫磷的抗性为常染色体遗传,主效基因为不完全显性。通过分析杂交F1代和敏感亲本回交后代的辛硫磷LD-P线,表明棉铃虫对辛硫磷的抗性为单基因性状。

棉铃虫对氰戊菊酯-辛硫磷混剂的抗性演化及解毒酶活性变化

用氰戊菊酯-辛硫磷混剂(有效成分1∶10,简称氰-辛混剂)对棉铃虫Helicoverpaarmigera室内品系(YS)进行16代的抗性选育,获得棉铃虫对氰-辛混剂的抗性品系(YS-FP)。YS-FP品系与YS品系相比,对氰-辛混剂的抗性为14.7倍,对其中的单剂氰戊菊酯和辛硫磷的抗性分别为2170倍和3.1倍。随着筛选的进行,氰戊菊酯和辛硫磷之间的共毒系数在F2代出现短暂的增加,然后逐渐降低,它们之间的互作由增效变为拮抗。交互抗性测定结果表明,YS-FP品系对氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、三唑磷和灭多威产生了明显的交互抗性,对硫丹、多杀菌素和爱玛菌素没有产生交互抗性。YS-FP品系6龄幼虫中肠细胞色素P450氧化酶甲氧基香豆素O-脱甲基活性为YS品系的10倍,3龄幼虫谷胱甘肽S-转移酶和酯酶活性分别是YS品系的1.7倍(CDNB结合作用)和2.4倍(α-NA酯酶水解作用)。氰-辛混剂的筛选导致了棉铃虫多种解毒酶活性的增加,特别是细胞色素P450氧化酶活性增强最为明显。本研究结果表明氰-辛混剂对棉铃虫的筛选导致了广谱的交互抗性和多种代谢抗性机理,并且两个单剂之间的互作由增效变为拮抗,因此氰-辛混剂在棉铃虫抗性治理中的作用是有限的和暂时的。