HIV-1 CRF01_AE重组型gp120 V1/V2结构域单克隆抗体的制备与鉴定

目的真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性。方法构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选分泌抗V1/V2重组蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤,对单克隆抗体的特异性、型别以及效价进行鉴定。结果制备并获得一株稳定分泌抗HIV-1 AE亚型V1/V2结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定腹水效价高达1∶81 000,单克隆抗体类型属于IgG1/κ型。Western blot结果表明该单克隆抗体同样能够识别不同亚型的HIV gp120蛋白。结论成功制备出抗HIV-1 AE重组型gp120蛋白V1/V2结构域的单克隆抗体。

HIV-1膜蛋白GP120V1/V2区域的真核表达、纯化和鉴定

目的:真核表达北美HIV-1分离株BAL和中国分离株CNE1两种毒株的V1V2,并纯化、鉴定其生物活性,为血清学分析鉴别HIV-1感染病人抗体反应及性质提供实验基础。方法:本研究将HIV-1北美分离株BAL和中国分离株CNE1两种毒株的V1V2基因序列定向克隆到多系统表达载体pTriEx-3 Hygro vector(Merck&Co.,Inc.)中,构建了表达质粒,并将表达质粒瞬时转染293T细胞,144小时后收获上清液,经浓缩、纯化后,SDS-PAGE电泳,Western blot检测蛋白的表达,ELISA检测其与HIV-1阳性病人血清的反应性。结果:经SDS-PAGE电泳、Western blot、ELISA方法证实确实得到了有免疫反应活性的V1V2蛋白,从表观分子量判断,表达的V1V2蛋白被糖基化修饰。使用V1V2蛋白作为抗原,分析发现中国HIV-1阳性病人体内比较广泛的存在着V1V2的抗体,为血清学的分析奠定了实验基础。

gp120蛋白多肽抗体的设计、制备与鉴定

目的:设计多肽免疫原,制备针对中国流行株B'亚型人类免疫缺陷病毒一型(HIV-1)gp120蛋白的抗血清和相应单克隆抗体。方法:通过蛋白抗原设计,设计出免疫原多肽,将多肽欧联载体蛋白免疫小鼠,制备小鼠多克隆抗血清和单克隆抗体;用ELISA实验、蛋白免疫印迹鉴定其活性和表位。结果:成功制备了能结合gp120蛋白的小鼠多克隆抗血清,并且获得4株分泌特异性抗免疫原的IgG1亚型的单克隆细胞株。结论:蛋白抗原设计是成功的,该多肽能诱导结合蛋白的抗体,有可能成为针对艾滋病病毒中国流行株的多肽疫苗。

4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物抑制HSV-2感染研究

目的:探索4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物(PSM)对单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染细胞或小鼠的抑制作用。方法:建立Vero-ICP10细胞系,通过Luciferase检测不同浓度PSM对感染细胞中HSV-2的抑制作用,并通过In cell western技术检测HSV-2 gD蛋白表达,确定不同PSM浓度对HSV-2 gD蛋白表达的抑制作用;建立HSV-2阴道感染小鼠模型,观察PSM对HSV-2经生殖道感染小鼠的抑制作用。结果:Luciferase实验和In cell western实验结果均表明PSM具有抗HSV-2感染细胞的作用;小鼠模型中,5%的PSM能有效防止小鼠感染HSV-2(P<0.001)。结论:PSM在体内和体外模型中均可以抑制HSV-2感染。

4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物抑制HIV-1的初步研究

目的研究4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物(PSM)对HIV-1的抑制作用。方法通过Luciferase检测不同浓度的PSM对易感细胞GHOST(3)X4/Hi5中HIV-1的抑制作用,观察PSM对北美HIV-1毒株JR-FL、HXB2和中国临床分离株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55的抑制作用;利用CCK8试剂盒测定PSM对VK2/E6E7生长的抑制率来观察PSM的体外细胞毒性。通过逆转录荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测生殖道上皮细胞HEC-1-A的紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin和Occludin的表达,观察PSM对生殖道上皮细胞HEC-1-A表达的紧密连接蛋白的影响从而间接评价其对局部黏膜完整性的影响。结果PSM对北美HIV-1毒株JR-FL、HXB2以及中国常见临床分离株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55的抑制EC50分别为5.78、0.77、1.85、3.15、1.70和2.27μg/mL,具有抗HIV-1感染的活性;PSM对VK2/E6E7细胞具有低毒性;PSM不明显抑制ZO-1的表达且增加了E-cadherin和Occludin的转录水平。结论 PSM可以抑制HIV-1感染,具有作为杀微生物剂的潜能。

HIV-1抑制蛋白N-SRCR单克隆抗体的制备与鉴定

目的唾液凝集素(salivary agglutinin,SAG)的主要结构域蛋白N-SRCR能够抑制HIV-1感染细胞。为了对N-SRCR和HIV-1病毒的作用机制进行系统研究,文中诱导制备并分离了抗N-SRCR蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法以CHO细胞表达的纯化蛋白N-SRCR免疫4周龄BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选分泌N-SRCR抗体的阳性杂交瘤细胞。用HiTrap Protein G柱纯化IgG抗体,SDS-PAGE检测纯化效果,间接ELISA确定效价,Western blot鉴定抗体特异性。结果获得1株稳定分泌抗N-SRCR蛋白的杂交瘤细胞株,命名为1D6。SDS-PAGE结果显示IgG抗体纯度较高,ELISA测定1D6抗体效价大于100×25。结论成功制备了抗N-SRCR的单克隆抗体,为进一步研究N-SRCR的生物学功能以及SRCR结构域与HIV-1囊膜蛋白gp120的相互作用提供了实验材料。

mTSLP-V1/V2融合蛋白的真核表达与鉴定

目的:将鼠胸腺基质淋巴细胞生成素(mouse thymic stromal lymphopoietin,mTSLP)与人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)B亚型分离株BAL的gp120 V1/V2结构域在293F真核细胞表达体系中进行融合表达。方法:以真核表达质粒pCEP-Pu为载体,构建mTSLP与gp120BALV1V2融合基因的重组蛋白表达质粒pCTV1V2BAL。限制性酶切电泳与测序验证质粒构建正确后,使用PEI瞬时转染293F悬浮细胞,表达产物以SDS-PAGE与Western blot进行分析,并对纯化后重组蛋白的V1/V2抗原表位进行了ELISA分析。结果:SDS-PAGE、Western blot分析显示,在表观分子量35 kD至55 kD的范围内存在一条不均一的糖蛋白条带,并且能与抗mTSLP多克隆抗体和抗His标签单克隆抗体发生反应。HIV-1阳性病人血清能够识别mTSLP-V1/V2BAL上的HIV-1V1/V2抗原表位。结论:在293F中成功表达了mTSLP-V1/V2BAL融合蛋白,该蛋白具有HIV-1gp120BALV1/V2区的抗原表位,能够用于HIV-1 gp120 V1/V2亚单位疫苗的研究。

羟丙基-β-环糊精包合物中尼非韦罗含量测定和稳定性考察

目的尼非韦罗是一种新型抗艾滋病药物,羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)包合物增加尼非韦罗的水溶性和稳定性。文中采用反相高效液相色谱法测定环糊精包合物中尼非韦罗含量及考察其相关稳定性。方法采用GL Sciences Inertsil ODS柱(4.60×250 mm,5μm),检测波长265 nm,柱温30℃。以甲醇(A相)-复方醋酸缓冲液(B相,pH4.5)(65∶35,v/v)为洗脱流动相,采用等速度洗脱,流速为1 ml/min,采用外标法定量。结果尼非韦罗与各有关物质分离良好。在20.10~180.90μg/ml的浓度范围内,尼非韦罗峰面积与浓度具有良好线性关系(r=0.9999);重复性好[相对标准差(relative standard deviation,RSD)<1.5%];稳定性好(RSD<1.5%);加样回收率为100.5%(n=9)。结论此方法检测包合物中尼非韦罗含量操作简便、准确、灵敏度高、可靠。尼非韦罗经HP-β-CD包合后相关稳定性有明显提高。

稳定表达人CCR5基因CHO细胞系的建立及鉴定

CC型趋化因子受体5(CCR5)是HIV-1感染机体所需的最重要的辅助受体和潜在的抗病毒药物靶点之一.将含有人CCR5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5稳定转染CHO-K1细胞,G418筛选2周后,在96孔板内通过有限稀释法培养细胞单克隆,最后得到22个细胞克隆,用流式细胞术检测细胞表面CCR5蛋白,发现克隆10能够高表达人CCR5基因.使用RT-PCR鉴定克隆10CCR5基因转录情况,结果在预期的位置检测出目的条带.采用细胞ELISA的方法进一步鉴定克隆10细胞表面CCR5的表达,结果该克隆的405nm光密度值是对照组的13.6倍.结果表明,本研究建立的稳定转染人CCR5的CHO细胞系能够高效表达CCR5基因,为研究HIV-1共受体、筛选病毒中和抗体、以及抗病毒药物奠定了基础.

人CCR5基因真核表达质粒的构建及其鉴定

目的:构建人CCR5基因的真核表达质粒并对其进行功能鉴定。方法:PCR扩增人CCR5基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1内,构建含人CCR5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5。使用RT-PCR、流式细胞术和HIV假病毒感染实验的方法,鉴定CCR5在真核细胞中的表达和功能。结果:克隆的人CCR5基因与GenBank中已登记的基因序列100%同源。瞬时转染真核细胞后,RT-PCR在预期的位置检测出目的条带,流式细胞术检测到约25.6%的细胞表达CCR5蛋白,且该蛋白能介导HIV假病毒的感染。结论:成功构建了含人CCR5基因的真核表达质粒。

中国HIV-1B'亚型流行株gp120蛋白的表达与纯化

目的:表达纯化中国HIV-1 B'亚型流行株gp120蛋白。方法:将gp120基因克隆至真核表达载体pTriEx-3 hygro,构建真核表达质粒pTriEx-3-gp120,转染CHO-K1细胞,96 h后收取上清,利用金属螯合层析的方法纯化该重组蛋白,并通过SDS-PAGE以及Western blotting验证重组蛋白的表达。结果:酶切及测序结果表明真核质粒表达构建正确,表达的重组蛋白可以被His标签抗体以及HIV-1阳性血清所识别,并从细胞转染上清中成功纯化了该蛋白。结论:我们成功构建了一个可用于免疫检测、疫苗设计以及其它相关研究的HIV-1免疫原。

sIgA在抗病毒治疗中的研究进展

免疫球蛋白A(IgA)主要分为血清型和分泌型。分泌型IgA(sIgA)是机体黏膜防御系统的主要成分,防止病原体入侵机体的第一道防线。sIgA分子通过直接结合病原体抗原,中和或阻断一系列病毒的活性,并阻止它们附着在宿主细胞上。sIgA在抗病毒领域的治疗潜力,使得sIgA在抗病毒领域备受关注,因此可能用于临床抗病毒治疗。本文重点对sIgA在抗病毒治疗中的应用现状及进展进行综述。

抗艾滋病药物F18和尼非韦罗在Solutol HS15形成复合制剂后的高效液相色谱测定

目的:解决F18和尼非韦罗二者水溶性差的问题,并建立F18和尼非韦罗两种药物混合物的高效液相色谱(HPLC)检测条件。方法:采用GL Sciences Inertsil ODS柱(4.60 mm×250 mm,5μm),检测波长265 nm,柱温30℃。以甲醇(A相)-复方醋酸缓冲液(B相,pH4.5)(65∶35,V/V)为洗脱流动相,采用等速度洗脱,流速为1 ml.min-1。结果:Solutol HS15能够很好地溶解F18和尼非韦罗,二者的出峰时间分别为34.3和14.2 min,最小检测限1μg.ml-1,20～180μg.ml-1的线性关系良好。结论:本研究所建立的分析检测条件为后续的研究提供有效的检测和分析手段,为以后的阴道杀微生物剂稳定制剂及联合用药奠定了基础。

靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的不对称siRNA的稳定性和体内分布研究

目的:探讨靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的不对称siRNA(asiRNA)在血清和动物体内的稳定性和在动物体内分布情况。方法:用内皮抑素同脂质胶束联合递送asiRNA,琼脂糖凝胶电泳法检测asiRNA的血清稳定性,ELISA法和活体荧光成像法检测asiRNA的体内分布。结果:改变合适的实验条件和asiRNA的修饰,可提高asiRNA的血清稳定性。用ELISA法检测出静脉给药15 min后双链asiRNA在血液、肝、肺和肾内浓度较高,用活体荧光成像法检测出静脉给药24 h后asiRNA向肾内汇集排泄,两种检测方法测得asiRNA在脾内浓度较低。结论:两种检测方法方便实用,灵敏度不同,均可用于阳离子脂质体递送asiRNA的体内分布检测。

阴道用尼非韦罗凝胶的大、小鼠急性毒性和家兔刺激性研究

目的:研究阴道用尼非韦罗凝胶的大、小鼠急性毒性和家兔刺激性。方法:取60只小鼠腹腔注射不同浓度(199、229、263、302、348、400mg·kg-1)的尼非韦罗凝胶进行全身急性毒性实验,计算半数致死量(LD50),观察14d内小鼠死亡数;对30只大鼠进行阴道急性毒性实验,分别阴道内给予尼非韦罗凝胶(5mg·kg-1)、空白凝胶,并设阴性对照,观察14d内大鼠体重变化、死亡数及生殖道形态学变化;对12只性成熟家兔进行阴道刺激性实验,分组为机械刺激组(生理盐水)、参比对照组(3%壬苯醇醚)、尼非韦罗凝胶组(1mg·kg-1)、空白凝胶组,阴道给予相应药物,连续给药10d,按Eckstein刺激性评价标准,以充血、水肿、炎性细胞浸润及上皮脱落为指标进行阴道刺激性评分。结果:尼非韦罗凝胶的小鼠LD50为303.37mg·kg-1,95%可信限为278.7～333.29mg·kg-1;大鼠14d内无死亡,体重无明显变化,生殖道未见异常分泌物;4组家兔阴道刺激性总分值比较无显著差异,刺激程度均在轻度以下。结论:尼非韦罗凝胶的全身急性毒性属中等毒性,阴道急性毒性和刺激性均在可接受范围内,总体评价较为安全,可作为阴道凝胶剂进行临床试验。

自然杀伤性T细胞(NKT细胞)的LIGHT通过减少保护性的肺泡巨噬细胞加剧严重流感性肺炎

CD1d限制的NKT细胞是一类固有免疫样T淋巴细胞,在流感引起的肺炎中可以起到保护或阻碍的作用.本研究发现浸润到肺并激活的NKT细胞是LIGHT/TNFSF14的主要细胞来源,LIGHT加重了高致病性流感病毒感染(IAV)造成的肺部炎症.与野生型小鼠相比,LIGHT^(-/-)小鼠由于减少了肺泡巨噬细胞(AM)的凋亡从而减轻了肺损伤,因此对IAV的发病率和死亡率要显著降低.LIGHT优先促进LTβR+,而不是HVEM+的AM死亡.这些结果表明,NKT来源的LIGHT增加了组织保护性AM的细胞死亡,从而加重了肺部病理和对高致病性流感病毒的易感性.封闭LIGHT信号可能是治疗流感相关急性呼吸窘迫综合征(ARDS)可行的选择.