湖北巴东县野生茶树种质资源遗传多样性及种群结构亲缘关系分析

野生茶树种质资源具有较高的遗传多样性,是开展茶树品种选育的优质基因库。收集了来自湖北省巴东县的26份野生茶树资源,利用简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)分子标记并结合对照栽培型茶树品种对野生茶树资源的遗传多样性及种群结构等进行分析。结果如下:(1)16对引物在供试材料中共扩增得到82个等位位点,每对引物扩增所得的等位基因范围为3~8个,平均检测出等位位点5.12个,有效位点数量3.65个,香农多样性指数平均值1.378。(2)从16对引物中筛选出6个核心引物位点,可对26份野生茶树进行有效检测并鉴别。(3)UPGMA进化树将48份材料分为7个类别,野生茶树与栽培型茶树能通过SSR标记进行有效划分;进一步种群遗传结构分析发现26份野生茶树可分为2个亚群。(4)依据生化成分含量,筛选得出2份高EGCG含量的茶树种质资源及2份适制红茶的茶树种质资源。研究结果显示,巴东野生茶树多样性丰富,种群内部遗传变异高,为进一步保护、开发和利用巴东野生茶树种质资源奠定了基础。

茶树春季发芽期的QTL定位及候选基因分析

春季发芽期(Timing of spring bud flush,TBF)是茶树重要的农艺性状,对茶叶的风味品质和经济效益均具有重要的影响。为了挖掘调控茶树TBF性状的关键候选基因,以龙井43×白毫早杂交的F1群体327株子代为材料,利用基于该群体构建的茶树高密度遗传图谱,采用MapQTL 6.0和GACD 1.2软件对茶树春季发芽指数(Sprouting indexs,SPI)进行数量性状基因座(QTL)定位。连续两年(2022、2023年)对群体子代的春季SPI进行观测,结果显示,SPI在F1群体内存在明显的性状分离,表现出数量性状的特征。利用MapQTL6.0软件定位到1个主效的QTL(qSPI-5-1),分别可解释18.30%(2022年)和7.60%(2023年)的表型变异;利用GACD1.2软件定位到2个稳定的QTL位点(qSPI-1,qSPI-5-2),解释2.75%~18.40%的表型变异,且qSPI-5-2与qSPI-5-1位点基本重合。进一步将上述3个位点的置信区间与茶树参考基因组进行比对,通过基因功能注释分析共筛选到23个与调控茶树春季发芽期相关的候选基因。研究结果为进一步探究茶树春季萌发的调控基因和分子机理提供了理论参考。

SSR标记鉴定浙江省主要无性系茶树品种的研究

为促进浙江省茶树育种的发展,利用SSR引物对浙江省茶树育成品种的遗传多样性进行了研究,筛选出可用于鉴别浙江省茶树品种的核心鉴定引物和标准品种,并进一步应用于未知茶苗身份鉴定。首先,利用35对SSR引物研究了36个茶树育成品种,并进行聚类分析;然后,根据电泳谱带和基因型筛选出核心鉴定引物和标准品种;最后,对4株未知茶苗进行了身份鉴定。结果表明：共有34对引物表现出多态性,各品种基本按遗传背景聚类,重复样本间遗传距离介于0-0.094;有10对引物确定为核心鉴定引物,8个品种为标准品种;4株未知身份茶苗中,NH-01属于乌牛早品种,另外3株并非浙江现有品种。本研究认为,核心鉴定引物在两个浙江育成品种间差异引物对≥2时,应判定为不同品种;差异引物对≤1时,应判定为相同品种或极相似品种,必要时应引入其余24对引物计算遗传距离进一步验证,遗传距离〉0.140判定为不同品种,遗传距离≤0.140判定为同一品种。

不同氮处理茶树实时定量PCR内参基因筛选和验证

为筛选不同氮处理下茶树(Camellia sinensis)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)试验体系中最佳内参基因,以茶树幼叶、成熟叶和幼根为材料,应用qRT-PCR分析GAPDH、18S rRNA、β-actin、RPL13、a-tubulin、Ru BP等6个内参基因在不同氮浓度和氮源处理下的表达变化,借助GeNorm和NormFinder程序对候选内参基因稳定性进行评价。结果表明,在不同氮浓度和氮源处理下,GAPDH、b-actin和RPL13表达稳定性较好,GAPDH+β-actin组合稳定性最佳,可用作茶树基因表达研究的内参基因;而a-tubulin和RuBP表达稳定性较差,不适合做内参基因。为进一步证实上述结果,分别以GAPDH、a-tubulin、GAPDH+β-actin组合为内参基因,分析茶树幼叶中硝酸根转运蛋白基因(CsNRT1.2)和铵根转运蛋白基因(Cs AMT1.1)的表达水平,发现以GAPDH和GAPDH+β-actin组合为内参基因时,目的基因的相对表达量随处理时间延长变化规律基本一致;而以a-tubulin为内参基因时,目的基因的变化规律与前两者存在明显差别。因此,根据特定试验体系选择合适的内参基因对于qRT-PCR定量结果的准确性和可靠性具有重要意义。

氮素水平对茶树重要农艺性状和化学成分含量的影响

以龙井43为对照,分析了不同氮素水平对4个茶树品系重要农艺性状和化学成分含量的影响。结果表明:氮素供应充足时,各茶树品系叶绿素含量提高,茶芽萌发和新梢生长加快,发芽密度与着叶数增加,可以有效提高茶叶产量;氮素影响氨基酸、咖啡碱和多酚类物质在茶树体内的代谢,施用氮肥可以增加茶叶中茶氨酸、咖啡碱等的含量,提高茶叶品质。本研究还发现中茗22号和LY002对氮素响应比较明显,可为今后氮素高效型茶树品种选育提供依据。

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof(DNA binding with one finger)基因CsCDF1的全长c DNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该c DNA序列全长1 606 bp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8 k Da,理论等电点(PI)为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白(Cycling dof factor)相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。

不同品种茶树生长对氮素浓度的响应差异

利用盆栽沙培法,研究了铁观音、福鼎大白茶、黄旦等6个基因型茶树对氮素浓度的响应差异。试验表明:(1)在低氮胁迫下茶树株高、根干重、地上部重、叶片SPAD值等显著降低;茶树根重、根冠比与茶树总生物量之间呈显著正相关(P<0.05)。(2)不同基因型茶树对氮素吸收利用能力差异较大,其中福鼎大白茶、春闺属低氮高效基因型。(3)低氮胁迫下,茶树根冠比显著增加,铁观音根冠比的变异幅度最大,为20.97%;基因型对茶树根冠比具有决定作用,不同基因型茶树根冠比的差异很大,如铁观音仅为0.71,春闺为1.81。(4)在低氮条件下,根冠比与叶片SPAD值可作为筛选耐低氮茶树品种的参考指标。

叶色特异茶树品种选育现状

叶色特异茶树的内含物成分有各自特点,因此具有开发特色或健康茶产品的前景。本文对白化、黄化、紫芽等叶色特异的茶树品种及品种授权情况进行了统计,并将物候期、化学成分含量进行了较为全面的汇总比较,为特异茶树品种推广、引种及特色新品种选育提供较为全面的参考信息。

温湿度变化对茶苗芽萌发基因表达的影响

利用数字基因表达谱技术研究了温湿度变化对秋插茶苗芽萌发基因表达的影响。通过保温棚处理日均温度提高约5.15℃,湿度提高5.10%,两者茶苗芽萌发具有明显差异。比较保温棚与对照芽的基因表达共筛选获得949个差异表达基因,其中503个基因受保温棚处理诱导上调表达,446个基因下调表达。对差异表达基因进行GO分类分析,在P值<0.01的情况下,有360个基因与14个GO分类匹配。其中7个GO分类与光合作用相关,P值最小的GO分类为光系统,其11个基因均表现为上调表达,说明高温高湿条件具有促进光合相关基因表达的作用。这些结果将为深入研究理解茶苗的生长机制及相关基因的克隆打下基础。

早生高香优质绿茶新品种——中茗66号

中茗66号是从杭州西湖龙井群体种中经过单株选拔、扦插扩繁和性状鉴定,选育出的优质绿茶品种。试验结果表明,中茗66号属特早生种,产量较高;制作的烘青茶样外形细紧、卷曲、显毫、嫩绿带翠较鲜活,汤色较嫩绿明亮,香气清高、鲜爽、花香显、毫香显,滋味尚浓醇、鲜爽,叶底细嫩、匀齐、有芽、绿明。春季第一轮一芽二叶含茶多酚18.1%、氨基酸5.1%、咖啡碱3.3%、水浸出物46.0%;抗炭疽病,感小绿叶蝉;适宜在杭州及气候相似地区种植。中茗66号于2021年通过农业农村部非主要农作物新品种登记,登记编号:GPD茶树(2021)330005。

春季扦插繁育中茶苗形态建成的调控研究

日前茶树育苗基本采用秋季短穗扦插技术，育苗周期长，一般为14～18个月，占用土地时间长，成本较高。春插在2-3月份进行，春插优点是苗圃充分利用，春季多雨，管理省工，是比较经济的茶树扦插模式。但是，由于春插茶苗需要70～90天才能发根，苗也不健壮。本研究对容器育苗及生长调节剂对茶苗地上部、地下部形态建成的影响进行了系统研究，探明春插过程中容器育苗及激素对茶苗形态建成中的作用机制。本研究还为今后在大田育苗上利用营养、化学调控等手段来促进扦插后初期的快速生长，缩短育苗时间，奠定基础。

云南双江勐库大叶种茶树基因型和种群结构分析

大叶种茶树在长期的自然演化过程中,形成了众多表型且表型的变异非常大,是研究茶树进化关系和育种的重要材料。云南省独特的地理和生态环境使其具有丰富大叶种茶树资源。勐库大叶茶(Camellia sinensis var. assamica ‘Mengkudayecha’)是原产于云南省双江县勐库镇的有性系国家良种,具有芽叶生育力强、持嫩性强等特点,作为主栽品种之一广泛栽培于云南西部、南部各产茶县。本研究收集取自云南省双江县11个区域的235份勐库大叶种茶树资源,结合SSR标记评估这些资源的遗传多样性及个体间的遗传关系,筛选合适的核心标记组合,并分析种群遗传结构。结果显示:SSR标记在待测样本中具有多态性,每个SSR位点的等位基因数为2~7个,平均等位基因数为3.84,观察杂合度Ho范围为0.18~0.74,均值0.47;25个SSR位点的基因分型组合能精确的识别出每份种质资源,赋予每份资源唯一的指纹码,并成功筛选出8个核心SSR位点作为简化的组合,以该组合检测235份种质资源,样本组两个随机样本存在同一基因型组合的概率仅为8.1e^-5~7.7e^-3;结合群体遗传结构分析,11个区域的235个样本被分为5个亚群(Sub-population R,G,Y,Pi,Pu)和3个组(Group Pu+Y,R+G,Pi+Y),并初步推测慕烈和冰岛区域的R亚群血统主要由南榔区域茶树资源向北部区域迁徙引入;Group Pu+Y和Group Pi+Y两个组所在区域的原生血统为Y亚群,且由于懂过区域茶树资源的迁徙而引入Pu和Pi亚群的血统。

浙江开化县茶树种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析

收集了浙江省开化县的不同茶树种质资源,利用SSR标记对资源的遗传多样性及个体间的遗传关系进行评估,筛选适于分子鉴别的核心标记组合,并分析样本的亲缘关系。研究结果显示:(1)14个SSR标记在供试样本中具有多态性,每个SSR位点的等位基因数为3~6个,平均等位基因数为4.14个,平均有效等位位点数为2.927个;(2)14个SSR位点的基因分型组合能精确的识别出每份种质资源,基于复合位点分析,成功筛选出10个核心SSR位点作为简化的组合,以该组合检测本试验的36份种质资源,其PE-1和PE-3分别超过0.99,PE-2超过0.95;(3)基于UPGMA构建进化树,将36份样本分为3个类群,并通过亲缘分析初步推测样本组中5个组合可能存在亲子关系。研究表明开化的茶树种质资源具有区别于现有育成品种的遗传背景,遗传多样性丰富。

茶树氮吸收效率的早期鉴定技术研究

氮是植物生长的重要营养元素,在茶树栽培过程中常需施用大量氮肥,不仅消耗大量的资源,施用不当还会造成一系列环境问题。培育氮肥高效利用的茶树品种是解决这一问题的重要途径,而建立快速筛选高效株系的早期鉴定方法对于缩短育种茶树育种年限具有重要意义。本研究分析龙井43(LJ43)和中茶108(ZC108)两个茶树品种在不同氮素水平下对氨态氮和硝态氮的吸收与利用数据,通过与^(15)N同位素标记技术的比对,验证非损伤微测技术(NMT)和实时荧光定量(qRT-PCR)技术在早期鉴定茶树株系氮素吸收利用能力方面的可行性与实用性,以期建立茶树氮吸收效率的室内早期鉴定技术。试验结果表明,^(15)N同位素标记技术的稳定性和可重复性分别为89.51%、99.26%,而NMT的稳定性、可重复性分别为95.22%、96.76%;两种方法测定结果均显示茶树具有明显的喜铵特性;硝酸根转运蛋白基因CsNRT3.2和CsNRT2.4在两个品种中均表现出诱导上调表达效应,相比中茶108,龙井43中CsNRT2.4和CsNRT3.2具有更高的表达量,表明LJ43对外界氮源的响应高于ZC108。综上所述,认为NMT技术可在短时间内处理并测得茶树的瞬时吸收速率,且试验材料损耗少,可以用于茶树氮瞬时吸收速率的早期鉴定;CsNRT2.4和CsNRT3.2的表达量一定程度上反映了茶树对硝态氮吸收的能力。本研究可为氮高效茶树品种的早期鉴定技术建立提供依据。

梧州茶树种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析

基于SSR标记对梧州六堡镇群体种和南渡镇野生大茶树种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行了分析,并筛选出用于该种质资源鉴别的核心分子标记。研究结果如下:(1)17对SSR引物在供试材料中共扩增得到98个等位基因,每对SSR引物扩增的等位位点为3~8个,平均每个位点5.7647个等位基因;(2)从17个SSR分子标记中筛选出8个核心标记组合即可区分每份种质资源;(3)六堡镇茶树种质资源的平均等位基因数(A)、基因型数、基因多样性(H)、多态性信息含量(PIC)分别为4.6471、7.0000、0.6754、0.6283,高于南渡镇野生大茶树种质资源,与栽培种茶树群体接近;(4)聚类分析表明,六堡镇茶树群体部分种质资源单独聚为一类,部分与云南的大叶种茶树,少量与浙江、贵州地方栽培种聚为一类;而南渡镇野生茶树种质资源单独聚为一类,仅有2个六堡镇的种质材料散落其间。综上所述,梧州茶树种质资源丰富,遗传多样性较高,研究结果为进一步开发和利用该资源奠定了基础。

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs(Amino acid permeases,氨基酸通透酶)基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH4NO3,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。

茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR的克隆及表达分析

以‘龙井43’茶树叶片的c DNA为模板,利用RT PCR技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因(CsNiR),得到完整的ORF全长为1 764 bp,编码587个氨基酸;所推导的氨基酸序列与垂枝桦(Betula pendula)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、菠菜(Spinacia oleracea)和水稻(Oryza sativa)的同源性均大于76%。生物信息学分析表明,CsNiR分子量为68.648 k D,等电点为6.12,为亲水性的非分泌蛋白;二级结构的预测显示,Cs Ni R具有完整的Ni R蛋白结构,含血红素蛋白β–化合物区域和4Fe-4S区域。实时荧光定量结果表明,该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培3个茶树品种,在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素(1和0.1 mmol·L^(-1) NH4NO3),q RT-PCR测定发现,正常氮素处理的2 h和6 h,诱导根CsNiR表达量显著增加,叶片中的表达量变化延迟到24 h之后,且变化幅度存在基因型之间的差异;低氮处理对CsNiR表达量的影响相对较小。因此,研究Cs Ni R基因的表达特性及其在茶树氮素利用中所发挥的作用,需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。