Bcl—2蛋白在急性白血病中的表达及意义

白血病的生物学特点表现为白血病细胞的过度增殖、分化停滞、凋亡减少,其结果导致白血病细胞在体内大量积聚,Bcl—2是细胞凋亡的一个重要调控基因,在某些血液肿瘤和恶性实体瘤中、Bcl—2基因的高表达与肿瘤耐药有关。我们应用免疫化学SABC—AP法检测了Bcl—2蛋白在59例急性白血病细胞中的表达,结果分析如下。 材料和方法 1 材料 1.1

TATPTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对白血病细胞系K562凋亡诱导作用

目的 研究基因重组 HIV- 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导域 (PTD)与 BCR/ ABL SH3结构域融合蛋白 (PTD-BCR/ ABL SH3)导入白血病细胞株 (K5 6 2 )的细胞后对 K5 6 2细胞增殖、凋亡的影响 .方法 通过台盼蓝拒染法、流式细胞术、透射电镜 (TEM)、激光共聚焦显微镜 (CL SM)及凋亡细胞原位标记 (TU NEL)等方法 ,测定了 PTD- BCR/ ABL SH3融合蛋白作用于 K5 6 2细胞后细胞的增殖、形态学变化、细胞凋亡和细胞周期参数的改变 .结果 ≥ 5μmol· L- 1 的 PTD-BCR/ ABL SH3融合蛋白对 K5 6 2细胞生长有抑制作用 ,浓度越高 ,抑制作用越强 ;苔盼蓝拒染法、细胞形态学、电镜超微结构、TUNEL原位杂交和 FCM检测的观察证明 ,PTD- BCR/ABL SH3融合蛋白可引起 K5 6 2细胞的凋亡和坏死 ;FCM检测显示该融合蛋白可将细胞阻滞在 G2 / M期 .结论 PTD-BCR/ ABL SH3融合蛋白进入 K5 6 2细胞后可引起细胞凋亡和坏死 ,导致细胞增殖抑制 .这一结果可能为慢性粒细胞性白血病 (CML )

PTD介导蛋白通过血脑屏障及其在脑组织中的分布

目的 :探讨HIV - 1TAT的蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)介导的大分子蛋白通过血脑屏障 (blood -brainbarrier,BBB)的作用及其在脑组织中的分布。方法 :将纯化的PTD -BCR/ABL融合蛋白及伊文思蓝经尾静脉注入小鼠体内 ,制备全脑组织恒冷箱连续切片 ,用免疫组织化学染色法检测PTD -BCR/ABL融合蛋白在脑组织中的分布 ,用伊文思蓝作为指示剂检测PTD对BBB开放的影响。结果 :将其注射到小鼠体内后 ,在全脑组织细胞中均检测到PTD -BCR/ABL融合蛋白 ,呈非特异性组织分布 ;全脑组织除无BBB区域外 ,余脑区均无伊文思蓝渗入 ,PTD不引起BBB的开放。结论 :PTD可在体内特异性介导大分子蛋白通过血脑屏障 ,并在全脑组织细胞中分布 ,为肽类或蛋白类大分子药物通过BBB进入中枢神经系统 (cen tralnervousystern ,CNS)开辟了一条新的途径。

蛋白转导域介导BCR/ABL抗原对CML患者T细胞的活化作用

目的 :研究蛋白转导域 (PTD)介导的BCR/ABL抗原对慢性髓细胞白血病 (CML)患者T细胞的特异性活化作用。方法 :利用基因工程技术 ,将PTD基因与CMLb3a2bcr/abl基因融合并原核表达。将纯化的PTD BCR/ABL融合蛋白与CML患者外周血单个核细胞 (PBMC)体外共孵育 ,用流式细胞仪分别检测CD4 + 、CD8+ T细胞上活化抗原CD2 5的表达。结果 :终浓度为 10 0mg/L的PTD BCR/ABL抗原体外刺激 4d后 ,10例CML患者中 ,5例表现为CD8+ T细胞活化 ,2例表现为CD4 + T细胞活化 ,其中有 1例CD8+ 和CD4 + T细胞同时活化 ;而作为对照的BCR/ABL抗原刺激组无一例表现为CD8+ 或CD4 + T细胞活化。结论 :PTD能将外源性BCR/ABL抗原转导入抗原呈递细胞内 ,加工呈递后激活抗原特异性CD8+ 及CD4 + T细胞 ,为CML特异性CD8+ 、CD4 +

流式细胞仪测定成人急性白血病患者DNA含量的临床意义

目的：为探讨急性白血病（ＡＬ）患者骨髓细胞的周期分布、非整倍体，及其与临床疗效的关系．方法：作者应用流式细胞仪（ＦＣＭ）测定了５７例ＡＬ患者的骨髓细胞ＤＮＡ含量．结果：不同类型ＡＬ患者骨髓细胞Ｓ％均明显低于正常对照和缓解后患者．急性早幼粒细胞白血病（Ｍ３）Ｓ％最低；ＡＬ患者骨髓细胞ＤＮＡ非整倍体检出率２９．８％，４例完全缓解的患者仍检出ＤＮＡ非整倍体细胞，随化疗进展而消失；对２１例ＡＬ患者骨髓细胞Ｓ％与化疗后原始细胞下降指数（ＢＲＩ），缓解率和复发的关系进行探讨，发现高Ｓ期组化疗后ＢＲＩ明显高于低Ｓ期组（Ｐ＜０．０１），但高Ｓ期组获得缓解的患者易于复发，而缓解率两组之间无差异（Ｐ＞０．０５）．

BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备

目的 克隆并表达 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备其抗血清 .方法 PCR扩增包含蛋白融合点的 bcr/ abl癌基因片段 ,序列测定后克隆入带有 His标签的原核表达载体 p ET-16 b,转化宿主菌 BL2 1,IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析表达结果 ,Ni- NTA树脂亲和纯化 ,皮下多点注射免疫小鼠 ,EL ISA确认抗血清的滴度 .结果 PCR扩增得到大小约 5 2 3bp的目的片段 ,序列测定表明与发表序列完全一致 ;得到了一种新的癌基因 bcr/ abl片段的原核表达载体 p ET- 16 b- bcr/abl,在 BL 2 1中表达可见于 Mr 2 1× 10 3处有一蛋白新生带 ,表达的 BCR/ ABL蛋白免疫小鼠后 ,EL ESA确认抗血清的滴度 >1∶ 2 0 0 0 .结论 成功的克隆、表达了 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备了相应的抗血清 .

非清髓单倍体造血干细胞移植联合格列卫治疗慢性粒细胞白血病

目的：探讨格列卫联合非清髓性单倍体造血干细胞移植在治疗慢性粒细胞白血病（CML）中的作用。方法：4例CML患者，采用移植前、后口服格列卫，以环磷酰胺、阿糖胞苷、抗胸腺细胞球蛋白、赛尼派、环胞素A等作非清髓性预处理的单倍体异基因外周血造血干细胞移植。结果：移植过程顺利，4例患者均植入成功，嵌合性植入。中性粒细胞〉0．5×10^9／L。天数，16（10～21）d；血小板〉20×10^9／L天数，10（4～15）d。3例发生I～Ⅱ度皮肤急性移植物抗宿主病（GVHD），1例发生Ⅳ度皮肤慢性GVHD。1例＋27d死于肺部感染并多脏器功能衰竭，1例死于Ⅳ度皮肤慢性GVHD并发感染。2例无病存活（随访16个月仍健在），且Ph^＋染色体，bcr-abl融合基因转阴。结论：非清髓单倍体造血干细胞移植联合格列卫治疗CML，具有降低移植前白血病细胞负荷，抑制残留白血病细胞增殖，促进供者完全嵌合状态的转变，增强抗移植物白血病（GVL）效应的作用，是一种有效的治疗方法，值得进一步临床研究。

抗PTD-bcr/abl多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备多克隆抗体并初步用于PTD -bcr/abl融合蛋白的研究 ,为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法 在大肠杆菌中表达PTD -bcr/abl融合蛋白 ,用所获得的蛋白免疫家兔得到多克隆抗体 ,并用免疫组化染色 ,Western -blot等方法进行此抗体的鉴定。结果 ①表达PTD -bcr/abl融合蛋白。②制备了抗PTD -bcr/abl融合蛋白多克隆抗体。③并用多克隆抗体以多种方法 ,检测PTD-bcr/abl融合蛋白 ,证实此抗体效价高、特异性强。结论 此抗体可用于PTD

维甲酸诱导HL-60细胞分化与细胞周期的关系

研究全反式维甲酸 (RA)在体外诱导人髓系白血病细胞系 (HL 60 )分化过程中细胞周期的改变。利用流式细胞术动态测定RA在体外诱导HL 60细胞分化过程中细胞周期的改变。结果发现 :①在RA与HL 60细胞共培养 4 8小时内 ,S +G2 /M期比例无明显变化 ,但S期细胞的比例改变与RA的浓度有关 ,在 10 - 6 mol/LRA浓度S期细胞比例先出现一过性升高 ,继而持续下降 ,在 10 - 5mol/L浓度S期细胞比例表现为持续性下降 ;②重培养试验证明 :S +G2 /M和S期细胞比例的下降与成熟分化细胞的增加相一致 ;③RA诱导HL 60细胞成熟分化并不是在一个时间点上同时进入分化状态 ,而一旦细胞开始进入成熟分化 ,即使在无RA存在的情况下 ,细胞仍能分化至成熟。结论提示 :RA与HL 60细胞必须相互作用一定时间后才能触发细胞成熟分化 ,S期细胞的比例改变与RA药物浓度有关 ,一旦细胞开始进入成熟分化 ,即使在无RA存在的情况下 。

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域 (PTD)与慢性粒细胞白血病 (CML)bcr/abl融合基因片段的质粒 ,并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CMLbcr/abl基因片段 ,经DNA测序后 ,与合成编码PTD的DNA片段一起插入质粒pET 16b ,构建表达载体pEPb ,转化大肠杆菌并进行了PTD bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的 5 2 3bp的目的片段被有效地扩增。DNA序列分析表明所构建的含PTD bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物 。

长期联合化疗对成人白血病患者外周血细胞姐妹染色单体交换率的影响

目的 :探讨长期联合化疗对缓解期成人白血病患者是否有潜在的诱变性。方法 :应用姐妹染色单体交换 (SCE)技术检测 44例白血病患者外周血细胞 SCE率的改变。结果 :初治、复发的急性白血病 (AL)和 CML组患者 SCE频率明显高于 CR- AL 组和正常对照组 ;CR- AL 仍有少部分高 SCE病例 (5 / 16 ) ,而此类病例主要分布在接受联合化疗在 9个疗程以上的 CR- AL 的患者中 (3/ 6 )。结论 :初治、复发 AL 和 CML 患者存在着 DNA的损伤或 DNA修复机制缺陷 ,长期反复联合化疗可能引起部分病例 DNA的不稳定。