青霉素酰化酶产生菌的分子育种及其产酶条件的研究

用EcoR1分别酶切质粒pACYC184和Ec108染色体,经连接、转化、筛选,得到7株克隆了青霉素酰化酶基因的转化体-C600(pPAHD1-7)。重组质粒pPAHD1在不同受体细胞内的酶活表达水平相差20倍。据此构建的工程菌其青霉素酰化酶活比出发菌株提高4～5倍。本文还对工程菌的产酶条件进行了研究。

用改良的羟胺法测定青霉素类物质

在青霉素类物质的物理—化学测定方法中,羟胺法因基于内酰胺环结构,故其结果可与生物测定方法一致,但该方法的显色稳定性极差,最多在5分钟内稳定。在反应条件分析基础上提出的改良羟胺法,显色在6小时内稳定,检测灵敏度也较Boxer方法提高约20％。本方法可广泛用于青霉素类物质(天然青霉素类、半合成青霉素类及6-APA)的测定。

重组质粒pPAHD1的限制性内切酶图谱分析

本文对我们构建的含有青霉素酰化酶(Acylace)基因的重组质粒pPAHD1进行了限制性内切酶图谱的测绘。使用了限制酶14种,证明BglⅡ,SalⅠ,SmaⅠ和BamHⅠ在重组质粒上各有切点一个;EcoRⅠ有切点两个:HindlⅡ,AvaⅠ各有切点三个;PvuⅠ有切点四个;EcoRⅤ和XmnⅠ各有切点五个。

青霉素酰化酶工程菌的褐藻胶固定化

本文报告以褐藻胶(海藻酸钠)固定化青霉素酰化酶工程菌的方法。本方法对大肠杆菌的包埋量可达30～40％(W/W),酶活回收率为88％。本文对6-APA测定的PDAB法进行了改进;对固定化细胞酶活的测定提出一种新方法。